Summary
La prueba de elevación de laberinto es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como el comportamiento de los ratones. A continuación, presentamos una película que muestra los procedimientos detallados para la realización de la prueba.
Abstract
Aunque el genoma del ratón está completamente secuenciado, las funciones de la mayoría de los genes expresados en el cerebro no se conocen. La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por el análisis del comportamiento de los ratones mutantes. Si un gen diana se expresa en el cerebro, el fenotipo conductual de los ratones mutantes para dilucidar el mecanismo genético de los comportamientos normales. La prueba de elevación de laberinto es una de las pruebas más utilizadas para medir la ansiedad-como comportamiento. La prueba se basa en la aversión natural de los ratones en las zonas abiertas y elevadas, así como sobre sus recursos naturales, el comportamiento espontáneo de exploración en ambientes nuevos. El aparato se compone de los brazos abiertos y los brazos cerrados, cruzó en medio perpendicularmente entre sí, y un área central. Los ratones se les da acceso a todas las armas y se les permite moverse libremente entre ellos. El número de entradas en los brazos abiertos y el tiempo empleado en los brazos abiertos se utilizan como índices de abrir un espacio de ansiedad inducido en ratones. Desafortunadamente, las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios hacen que sea difícil de duplicar y comparar los resultados entre laboratorios. A continuación, presentamos una película detallada que demuestra nuestro protocolo de la prueba del laberinto más elevado. En nuestro laboratorio, hemos evaluado más de 90 cepas de ratones mutantes utilizando el protocolo se muestra en la película. Estos datos serán divulgados como parte de una base de datos pública que ahora estamos construyendo. Visualización del protocolo promoverá una mejor comprensión de los detalles del procedimiento experimental completa, que permite la estandarización de los protocolos utilizados en los diferentes laboratorios y comparaciones de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de esta prueba.
Protocol
Protocolo
- El aparato utilizado para la prueba del laberinto más elevada está en la configuración de un + y consta de dos brazos abiertos (25 x 5 x 0,5 cm) a través de sí y perpendiculares a los dos brazos cerrados (25 x 5 x 16 cm) con un centro de plataforma (5 x 5 x 0,5 cm). Los brazos abiertos tienen una muy pequeña (0,5 cm) de la pared para disminuir el número de caídas, mientras que los brazos cerrados tienen un alto (16 cm) de la pared para encerrar el brazo. Todo el aparato es de 50 cm sobre el suelo (Ohara & Co., de Tokio) y se coloca en un tanque vacío circular (100 cm de diámetro, 35 cm de altura, normalmente se utiliza para la tarea laberinto de Morris) para proteger a los ratones que caen o intento de escapar durante el experimento. El aparato está fabricado con materiales de plástico. La plataforma es de color blanco y las paredes son transparentes. Hay una variación en los materiales y los colores de los aparatos de laberinto elevado.
- Los ratones se encuentran con una luz de 12 h / oscuridad ciclo (luces a las 7:00 AM), como se describió previamente (Takao y Miyakawa, 2006a). Las pruebas de comportamiento se lleva a cabo 09 a.m.-06:00 PM. Todos los ratones experimentales se transfieren a las pruebas de comportamiento sala 30 minutos antes del comienzo del primer juicio a habituarse a las condiciones de la sala de pruebas de comportamiento. El orden de los ensayos se compensa a través de los genotipos. Hay dos efectos de la prueba de ensayo con un animal de la práctica. Uno de ellos es para asegurarse de que todo está bien con el sistema de grabación. Otra es la de mantener la condición de prueba lo más uniforme posible. Es decir, el ratón muy por primera vez en toda la sesión sería condición experimentan algo diferente con los demás (es decir, no hay ruido previo realizado por las operaciones de prueba y no señales del olor de los ensayos previos), sin una prueba práctica. Los animales son mantenidos de acuerdo con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Kyoto.
- La sala de pruebas de comportamiento (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co., de Tokio) está insonorizada y el nivel de iluminación se mantiene a 100 lux. Se coloca un ratón en la zona centro del laberinto, con su cabeza dirigida hacia un brazo cerrado. La prueba de laberinto elevado se registra con una cámara de vídeo conectada a un ordenador, que es controlada por un dispositivo remoto. El número de entradas (una entrada se define como el centro de masa del mouse entra en el brazo) en cada brazo y el tiempo empleado en los brazos abiertos y se registran estas mediciones sirven como un índice de ansiedad-como comportamiento.
- Los ratones se les permite moverse libremente por el laberinto durante 10 minutos. Cada ratón recibe una prueba de nuestra batería de pruebas. La aplicación que se utiliza para obtener y analizar los datos de comportamiento (imagen EP) se basa en el programa J dominio público de la imagen (desarrollado por Wayne Rasband en el Instituto Nacional de Salud Mental y está disponible en http://rsb.info.nih.gov/ ij / ), que fue modificada por Tsuyoshi Miyakawa (disponible a través de O'Hara & Co., Tokio, Japón).
- La distancia recorrida, el número de entradas en cada brazo, el tiempo empleado en cada brazo, y el porcentaje de entradas en los brazos abiertos son calculados por el programa EP imagen.
- Después de cada ensayo, todas las armas y la zona centro se limpian con agua súper hipocloroso, que es un agente de eliminación de olores eficiente y tiene un olor relativamente débil de sí mismo en comparación con otras soluciones de limpieza, para evitar un sesgo sobre la base de señales olfativas. Por tanto, podemos realizar las pruebas bajo condiciones controladas con respecto a señales olfativas.
Discussion
Aunque el genoma del ratón ha sido secuenciado, las funciones de la mayoría de los genes no se conocen. Técnicas de modificación genética permite la eliminación u otra manipulación de un gen específico en ratones (Austin et al, 2004;.. Aiba et al, 2007). La influencia de un determinado gen en una determinada conducta puede ser determinada por la realización de análisis de comportamiento de los ratones mutantes (Takao y Miyakawa, 2006b;. Takao et al, 2007).
La prueba de elevación de laberinto es una de las pruebas más populares de todos los modelos animales disponibles en la actualidad de la ansiedad (Rodgers y Dalvi, 1997; Crawley, 2007). Esta prueba de la ansiedad-como el comportamiento ha sido utilizado para la detección y el fenotipo de ratones transgénicos y knock-out (Crawley, 1999) y de descubrimiento de fármacos (Hogg et al 1996;. Crawley, 2007). La prueba de elevación de laberinto tiene una validez predictiva sólida para la detección de fármacos ansiolíticos (Rodgers y Dalvi, 1997; Mechiel Korte y De Boer, 2003; Crawley, 2007); ansiolíticos específicamente aumento, y las drogas ansiogénicos disminución en concreto, el número de entradas en los brazos abiertos y el tiempo que pasé allí. La puntuación total de entradas y la distancia total se considera un índice útil de la actividad general. Puntuación total de entradas es también un índice de ansiedad, y los porcentajes de las entradas y el tiempo invertido en cada brazo constituyen el índice de ansiedad primario (Rodgers y Dalvi, 1997, Mechiel Korte y De Boer, 2003). Los brazos abiertos y cerrados se consideran para evocar la unidad de exploración mismo, por lo tanto, la evitación de los brazos abiertos se considera ser el resultado de la inducción de los niveles más altos de miedo (Rodgers y Dalvi, 1997). Se cree que la aversión de los ratones para explorar los brazos abiertos del laberinto es causada por el temor a los espacios abiertos y elevados.
En 1984, Handley y Mithani informó sobre el trabajo preliminar con la prueba del laberinto elevado X (más) se ha descrito anteriormente. El aparato de prueba original fue levantado 70 cm del suelo, y compuesto por dos cerrados y dos brazos abiertos, cada uno de los cuales mide 45 cm de largo por 10 cm de ancho. En sus estudios iniciales, se informó la razón de las entradas de brazo abierto / total (Handley y Mithani, 1984). Posteriormente, se desarrollaron otros índices que incluyen el número de entradas en los brazos abiertos y cerrados y el tiempo empleado en los brazos cerrados y abiertos para las ratas (Pellow et al, 1985; Pellow y Archivo, 1986) y ratones (Lister, 1987) .
Cambios en la prueba del laberinto más elevado incluyen alargamiento de ambos los brazos abiertos (50 x 10 cm) y los brazos cerrados (50 x 10 x 40 cm) con altos muros que rodean y un techo abierto en los brazos cerrados, y el laberinto entero fue elevada a una altura de 50 cm (Pellow et al, 1985; Pellow y Archivo, 1986). En la actualidad, en nuestro laboratorio, el aparato más elevados prueba del laberinto está configurado en forma de +, con dos brazos abiertos (25 x 5 cm, con una muy leve, de 0,5 cm, la pared) a través de sí y perpendiculares a dos brazos cerrados (25 x 5 x 16 cm), y se eleva 50 cm sobre el suelo (Miyakawa et al, 1996; Manabe et al, 2000; Miyakawa et al, 2001; Seeger et al, 2004; Morishima et al, 2005; Miyamoto et al, 2005; Arrow et al, 2006; Hattori et al, 2007; Niemann et al, 2007; Sano et al, 2008; Horii et al, 2008; Fukuda et al, 2008; Ikeda et al, 2008). El ratón se coloca en el centro de la + (5 cm x 5 cm) y se le permite explorar el laberinto libremente. Aunque cinco minutos de grabación es común, el comportamiento se registra durante 10 minutos en el protocolo para aumentar la oportunidad de detectar el fenotipo. Los brazos en alto abiertos y cerrados provocar un conflicto de exploración (Mechiel Korte y De Boer, 2003; Crawley, 2007).
Las medidas de la prueba del laberinto más elevados se registran por un observador durante el experimento. En nuestro laboratorio, la prueba se grabó con una cámara de vídeo conectada a un ordenador y los datos de comportamiento (imagen EP) son adquiridos y analizados utilizando el programa EP imagen. Número de entradas en los brazos abiertos frente al número de entradas del brazo total, y el tiempo empleado en los brazos abiertos frente a los brazos cerrados, suministrar a las medidas de ansiedad-como comportamiento.
Se evaluaron más de 90 cepas de ratones mutantes modificados genéticamente mediante el protocolo se muestra en la película y tiene un gran conjunto de datos en bruto para más de 5.000 ratones (incluidos de tipo salvaje y ratones mutantes). En nuestra batería de pruebas, de tipo salvaje camada suelen ser utilizados como control. Como una cepa de fondo, los ratones C57BL/6J son ampliamente utilizados. Se recogieron los datos de los ratones C57BL/6J en las pruebas de comportamiento. Los valores obtenidos de ratones C57BL/6J en nuestra prueba de laberinto elevado son los siguientes (n = 914; media ± SEM), la distancia total recorrida: 1.547,55 14,27 cm, la duración del tiempo pasado: 56,49 2,42 s (brazos abiertos), 384,02 3,13 s (brazos cerrados), 161,90 2,17 s (centro de laberinto), proporción de tiempo dedicado en los brazos abiertos: 9.19 0.36%, la proporción de tiempo empleado en los brazos cerrados: 63,82 0,52%, el número de entradas: 7,64 0,21 (brazos abiertos), 24,32 0,28 (brazos cerrados);% las entradas de abrir el brazo: 21,9 0,05% cerrando las entradas de los brazos: 78,1 0,05. Ratones C57BL/6J pasar menos tiempo en los brazos abiertos que en los brazos cerrados (p <0,0001, n = 914, a la par-test). Esto indica que los ratones C57BL/6J tienden a evitar los brazos abiertos, y que el tiempo empleado en los brazos abiertos es un índice válido de ansiedad-como comportamiento. Además, el orden de los ensayos se compensa a través de los genotipos, ya que el número de juicio afecta al tiempo de permanencia en los brazos abiertos y la plataforma del centro. Es decir, los índices se incrementan durante los días 3 y 4 ratones en comparación con el primero ratones (p = 0.0089, n = 476) (datos no publicados). Con nuestro protocolo, análisis de más de 1.661 ratones mostraron que el orden secuencial de los ratones en una jaula a prueba no afecta significativamente el tiempo de estancia brazo abierto (datos no publicados). Es decir, las actuaciones de los primeros ratones tomada de la jaula no difieren significativamente de las del segundo, el tercero o los ratones pasado.
Aunque la prueba de elevación de laberinto y la prueba de la transición de luz / oscuridad son utilizados para la evaluación de la ansiedad-como el comportamiento, los resultados no son siempre coherentes entre sí (Holmes et al, 2000; Tujimura et al, 2008; Nakajima et al, en prensa ) Por ejemplo, el prosencéfalo específicos nocaut calcineurina ratones pasar una disminución en la cantidad de tiempo en la cámara de luz en la prueba de la transición de luz / oscuridad, pero una mayor cantidad de tiempo en los brazos abiertos en la prueba del laberinto elevado más (Miyakawa et al. , 2003). El análisis factorial de nuestra batería de pruebas de comportamiento indica que la prueba de elevación de laberinto y la prueba de la transición de luz / oscuridad evaluar los diferentes aspectos de la ansiedad-como el comportamiento, tales como brillante del espacio de ansiedad en la prueba de la transición de luz / oscuridad y abrir el espacio-la ansiedad-como comportamiento en el ensayo a campo abierto (Takao y Miyakawa, 2006b; Yamasaki et al, 2006). En consecuencia, tanto la luz / oscuridad de la prueba de transición y la prueba de laberinto elevado se incluyen en nuestra batería de pruebas de comportamiento.
Crabbe y sus colegas informaron que variables no controladas y caracterización de los experimentos mutantes pueden producir resultados que son específicos de un laboratorio particular (Crabbe et al., 1999). Las diferencias de procedimiento que existe entre los laboratorios hacen que sea difícil de replicar o comparar los resultados entre ellos. El establecimiento de la documentación visual del protocolo promover una mejor comprensión de los procedimientos experimentales, lo que permite la estandarización de los protocolos utilizados en laboratorios y para la comparación de los fenotipos del comportamiento de las distintas cepas de ratones mutantes evaluó a través de estas pruebas. Anteriormente hemos publicado un protocolo de cine de la prueba de la transición de luz / oscuridad (Takao y Miyakawa, 2006a). Del mismo modo, las películas de otros protocolos, como por ejemplo la prueba de campo abierto, la prueba de natación forzada Porsolt, y las pruebas de miedo acondicionado que utilizamos en nuestra batería de pruebas de comportamiento se están realizando para la publicación de futuros artículos de revistas de vídeo.
Disclosures
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Uso de Animales y el Comité de Atención de la Universidad de Kyoto.
Acknowledgments
Esta investigación fue financiada por becas-en-Ayudas a la Investigación Científica de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), Grant-in-Aid del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón, Grants-in- La ayuda de los AVE y la cresta de Japón Agencia de Ciencia y Tecnología, Grant-in-Aid de Neuroinformática Japan Center (NIJC), RIKEN y por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en la investigación del cerebro áreas prioritarias-Integrativa (Shien) - de MEXT en Japón. Damos las gracias a O'hara & Co. y Hayashi Mariko por su ayuda en la creación de esta película.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
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