Summary
Yükseltilmiş artı labirent testi, farelerde davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Burada, test yapılması için ayrıntılı yordamlar gösteren bir film sunuyoruz.
Abstract
Fare genomu artık tamamen sıralı olmasına rağmen, beyinde ifade edilen genlerin çoğunun fonksiyonları bilinmemektedir. Verilen bir genin belirli bir davranışı üzerinde etkisi mutant farelerde davranış analizi ile tespit edilebilir. Eğer bir hedef gen, beyin olarak ifade edilir, mutant farelerin davranışsal fenotip normal davranışların genetik mekanizmayı açıklığa kavuşturduk. Yükseltilmiş artı labirent testi, davranış gibi anksiyete ölçmek için en yaygın kullanılan testler biridir. Test yükseltilmiş ve açık alanlarda farelerin doğal kaçınmanın yanı sıra, roman ortamlarda doğal kendiliğinden keşif davranışı üzerinde dayanmaktadır. Cihaz, silah ve kapalı silah, birbirine dik ortada geçti ve bir merkez alan açık oluşur. Fare tüm silah verilir ve aralarında serbestçe hareket etmesine izin verilir. Kollar açık ve açık kollarında harcanan zaman giriş sayısı, açık alan farelerde indüklenen anksiyete endeksleri olarak kullanılmaktadır. Ne yazık ki, laboratuarlar arasında mevcut usul farklılıkları zor yinelenen ve laboratuarlar arasında sonuçları karşılaştırmak. Burada, yükseltilmiş artı labirent testi için bizim protokol gösteren ayrıntılı bir film sunuyoruz. Laboratuvarımızda, 90'dan fazla filmin gösterildiği protokolünü kullanarak mutant farelerin suşları değerlendirilmiştir. Bu veriler, şimdi inşa kamu veritabanının bir parçası olarak ilan edilecektir. Protokol Görselleştirme mutant farelerde çeşitli suşları davranış fenotipleri farklı laboratuvarlar ve karşılaştırmalarda kullanılan protokoller standardizasyonu sağlayan, tüm deneysel işlemin detayları daha iyi anlaşılmasını sağlamak, bu test ile değerlendirildi.
Protocol
Protokol
- Yükseltilmiş artı labirent testi için kullanılan aparat + yapılandırma ve iki kapalı bir merkezi ile silah (25 x 5 x 16 cm) karşısında dik her iki açık silah oluşmaktadır (25 x 5 x 0,5 cm) platformu (5 x 5 x 0,5 cm). Kapalı, kollar kol içine yüksek bir duvar (16 cm) var ise açık kollar, düşme sayısını azaltmak için bir çok küçük (0.5 cm) duvar var. Tüm aparatları, zeminden 50 cm (Ohara & Co, Tokyo) ve boş bir yuvarlak tankı (35 cm boyunda 100 cm çapında, Morris su labirenti görev için normalde kullanılan) yerleştirilir veya düşme fareleri korumak için deney sırasında kaçmaya çalışmayın. Cihaz, plastik malzemelerin yapılır. Platform, beyaz ve duvarları şeffaf. Cihazı yükseltilmiş artı labirent malzeme ve renkler bir varyasyon vardır.
- Fareler 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü (7:00 PM ışıklar) ev sahipliği yapmaktadır, daha önce (Takao & Miyakawa, 2006a). Davranışsal test 9:00 arasında yapılan ve 6:00 AM. Tüm deney fareleri davranış test odası durumuna alışmakta ilk deneme başlamadan önce davranışlarını test odası 30 dakika aktarılır. Çalışmalarda sırası genotipler arasında dengeli. Bir uygulama hayvan kullanarak test deneme iki amacı vardır. Her şeyi kayıt sistemi ile iyi olduğundan emin olun. Başka bir üniforma olarak test durumu mümkün olduğunca tutmak için. Yani, böyle bir uygulama deneme tüm oturumda ilk fare olmadan diğerleri (yani, test işlemleri ve önceki çalışmalarda hiçbir koku ipuçları tarafından yapılan önceden hiçbir sesler) ile biraz daha farklı bir durum deneyim olacaktır. Hayvanlar, Kyoto Üniversitesi Hayvan Araştırma Komitesi kurallarına göre korunur.
- Davranış test odası (170 x 210 x 200 cm, Ohara & Co, Tokyo) ve ses yalıtımlı ve aydınlatma seviyesi 100 lux tutulur. Bir fare, kapalı bir kol yönelik merkez labirentin merkezinde alanda yer almaktadır. Yükseltilmiş artı labirent testi, bir uzaktan kumanda ile kontrol edilir bir bilgisayara bağlı bir video kamera, kullanarak kaydedilir. Her kol ve açık kollarında harcanan zaman içine girişlerin sayısı (bir giriş fare kitle kol girer merkezi olarak tanımlanır) ve bu ölçümlerin, kaygı gibi davranış bir göstergesi olarak hizmet vermektedir.
- Fare 10 dakika labirent hakkında serbestçe hareket etmesine izin verilir. Her fare test bataryası bir deneme alır. Davranışsal verileri (Görüntü AP) edinme ve analiz etmek için kullanılan uygulama, kamu malı Görüntü J programı (Wayne Rasband Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü tarafından geliştirilen ve mevcut dayanmaktadır http://rsb.info.nih.gov/ ij / Tsuyoshi Miyakawa (O'Hara & Co, Tokyo, Japonya üzerinden kullanılabilir) tarafından güncellenmiştir).
- Bu mesafe, yolculuk, her kol giriş sayısı, her kolunda harcanan zaman ve açık kollarına girdiler yüzde Resim EP program tarafından hesaplanır.
- Her denemede sonra, tüm silah ve merkez alan etkin bir koku giderici ve koku alma ipuçları dayalı bir önyargı önlemek için kendisini diğer temizleme solüsyonları ile karşılaştırıldığında nispeten zayıf kokulu, süper hipokloröz su ile temizlenir. Böylece koku alma ipuçları ile ilgili kontrollü koşul altında testleri yapabilirler.
Discussion
Farenin genom dizisi olmasına rağmen, genlerin fonksiyonları bilinmemektedir. Genetik modifikasyon teknikleri, belirli bir genin, farelerde (; Aiba ve ark, 2007 Austin ve ark, 2004) silinmesi veya diğer manipülasyon için izin verir. Belirli bir davranışı üzerinde verilen bir genin etkisi mutant fareler (Takao ve ark, 2007 Takao ve Miyakawa, 2006b) davranışsal analizler yaparak tespit edilebilir.
(Crawley, 2007 Rodgers ve Dalvi, 1997) yükseltilmiş artı labirent testi, anksiyete, tüm mevcut hayvan modellerinde en popüler testleri biridir. Bu test, davranış gibi anksiyete için tarama ve fenotipleme transgenik ve nakavt fareler (Crawley, 1999) ve ilaç keşfi için kullanılır olmuştur (. Hogg ve ark 1996; Crawley, 2007). Yükseltilmiş artı labirent testi anksiyolitik ilaçlar (Rodgers ve Dalvi Mechiel Korte ve De Boer, 2003; Crawley, 2007, 1997); tarama için güçlü bir öngörü geçerliliği vardır, girişlerin sayısı içine anksiyolitik ilaçlar, özellikle artırmak ve anksiyojenik ilaçların özellikle azaltmak kollar açık ve zaman harcadı. Toplam girdileri puan ve toplam mesafe genel faaliyet yararlı bir indeksi olarak kabul edilir. Toplam girişler skoru da anksiyete bir göstergesi olup, her iki kolunda da harcanan zaman girişleri ve yüzdeleri primer anksiyete indeksi (Dalvi ve Rodgers, 1997, Mechiel Korte ve De Boer, 2003) oluşturmaktadır. Açık ve kapalı silah aynı keşif sürücüyü uyandırmak için kabul edilir, bu nedenle açık silah kaçınma, korku yüksek seviyelerde (Rodgers ve Dalvi, 1997) indüksiyon bir sonucu olarak kabul edilir. Bu yükseltilmiş ve açık alanlarda korkusu neden farelerin kaçınma açık kollar labirent keşfetmek için düşünülüyor.
1984 yılında, Handley ve Mithani yükseltilmiş X (artı) yukarıda açıklanan labirent testi ile ön çalışma bildirdi. Orijinal test aparatı, yerden 70 cm yükseltilmiş ve her biri 45 cm uzunluğunda 10 cm genişliğinde ölçülen iki kapalı ve iki açık kollar, oluşuyordu. Ilk çalışmalarda, toplam açık / kol girişlerinin oranı (Handley ve Mithani, 1984) bildirdi. Ve fareler (Lister, 1987); Daha sonra, diğer endeksleri, sıçan (Pellow ve Dosya, 1986 Pellow ve ark, 1985) için kapalı ve açık silah harcanan açık ve kapalı silah ve zaman içine girişlerinin sayısını içeren geliştirildi .
Yükseltilmiş artı labirent testi değişiklikler açık silah (50 x 10 cm) ve uzun boylu çevreleyen duvarlar ve kapalı kollar açık bir çatı ile kapalı silah (50 x 10 x 40 cm), uzatma ve tüm labirent artmıştı yüksekliği 50 cm (Pellow ve Dosya, 1986 Pellow ve ark, 1985). Halen, laboratuar, yükseltilmiş artı labirent testi cihazı iki karşısında dik her iki açık silah (çok hafif 25 x 5 cm, 0.5 cm, duvar) + şeklinde yapılandırılmış Manabe ve ark, 2000; Miyakawa ve ark, 2001; Seeger ve ark, 2004; Morishima ve ark, 2005; kapalı silah (25 x 5 x 16 cm) ve zeminden 50 cm (Miyakawa ve ark, 1996 yükseltilir Miyamoto ve ark, 2005; Ok ve ark, 2006; Hattori ve ark, 2007; Niemann ve ark, 2007; Sano ve ark, 2008; Horii ve ark, 2008; Fukuda ve ark, 2008; Ikeda ve ark, 2008). Fare + (5 cm x 5 cm) merkezine yerleştirilir ve serbestçe labirenti keşfetmek için izin verilir. 5 dakika kayıt yaygın olmasına rağmen, davranış fenotip algılamak için fırsat artırmak için 10 dakika protokolde kaydedilir. Açık ve kapalı yükseltilmiş silah, bir keşif çatışma (; Crawley, 2007 Mechiel Korte ve De Boer, 2003) neden olur.
Yükseltilmiş artı labirent testi önlemler, deney sırasında bir gözlemci tarafından kaydedildi. Laboratuvarımızda, test, bir bilgisayar ve davranışsal verileri (Görüntü AP) satın aldı ve Resim EP programı kullanılarak analiz bağlı bir video kamera ile kaydedilir. Karşısında açık kapalı silah silah harcanan toplam kol girişlerin sayısı karşısında silah ve zaman açık üzerine girişlerin sayısı, kaygı gibi davranış önlem alınmasını sağlamaktadır.
Biz 90'dan fazla filmin gösterildiği protokolünü kullanarak genetiği mutant farelerin suşları değerlendirdi ve 5000'den fazla fareler (yabani tip ve mutant fareler dahil) ham veriler büyük bir set var. Test bataryası, yabani tip littermates genellikle kontrol olarak kullanılır. Bir arka plan gerginlik olarak, C57BL/6J farelerin yaygın olarak kullanılmaktadır. Biz davranış testleri C57BL/6J farelerin veri topladı. Yükseltilmiş artı labirent testinde C57BL/6J fareler elde edilen değerler aşağıdaki gibidir (n = 914; SEM); toplam katedilen mesafe: 1547,55 14,27 cm; harcanan zaman süresi: 56,49 2.42 (kollar açık), 384,02 3.13 s (kapalı kolları), 161,90 2.17 (labirent merkezi); zaman oranı kolları açık geçirdi: 9.19 0.36%, kapalı silah harcanan zamanı oranı: 63.82% 0.52; girişlerin sayısı: 7.64 0.21 (kollar açık) 24.32 0.28 (kapalı kolları);% açık kol entries: 78.1 0.05 21.9 0.05,% silah girişlerini kapattı. C57BL/6J fareler, kolları açık, kapalı silah (p <0.0001, n = 914, eşleştirilmiş-t t daha az zaman harcamakEST). Bu C57BL/6J fareler açık kollar önlemek için eğiliminde olduğunu gösterir ve kollar açık harcanan zaman, kaygı gibi davranış geçerli bir dizin olduğunu. Ayrıca, deneme sayısı, kolları açık ve merkezi bir platform harcanan zamanı etkiler, çünkü çalışmaların sırasını, genotipler arasında dengeli. Yani, endeksler, 1. fareler (p = 0,0089, n = 476) (yayınlanmamış veriler) ile karşılaştırıldığında, 3. ve 4. fare sırasında tüm artış. Protokol ile, 1661 farelerin fazla analizi bir kafes test farelerin sırayla açık kol kalış süresi (yayınlanmamış veri) önemli ölçüde etkilemez gösterdi. Yani, kafes alınan ilk farelerin performansları da önemlisi, bu ikinci, üçüncü veya son fareler farklılık yoktur.
Tujimura ve ark, 2008; Nakajima ve ark basın yükseltilmiş artı labirent testi ve açık / koyu geçiş testi her ikisi de anksiyete gibi davranış değerlendirmek için kullanılır olmasına rağmen, sonuçlar her zaman onlara (Holmes ve ark, 2000 tutarlı değil. ) Örneğin, ön beyin özel kalsinörin-knockout farelerde, ışık açık / koyu geçiş test odasında azalmış bir miktar zaman harcamak, ancak yükseltilmiş artı labirent testi (Miyakawa ark kolları açık bir zaman miktarının artması. , 2003). Davranışsal test bataryası faktör analizi yükseltilmiş artı labirent testi ve açık / koyu geçiş testi, kaygı gibi davranış, açık / koyu geçiş test parlak boşluk kaygı ve anksiyete gibi açık alan gibi farklı yönlerini değerlendirmek olduğunu gösterir açık alan testi (Yamasaki ve ark, 2006 Takao ve Miyakawa, 2006b) davranış. Buna göre, açık / koyu geçiş testi ve yükseltilmiş artı labirent testi hem de davranışsal test bataryası dahildir.
Crabbe ve arkadaşları mutantlar karakterize kontrolsüz değişkenler ve deneyler belirli bir laboratuvar (Crabbe ve ark, 1999) özgü sonuçlar verebilir. Laboratuarlar arasında mevcut usul farklılıkları zor çoğaltmak veya aralarında sonuçları karşılaştırmak olun. Protokol görsel belgeler oluşturulması, bu testler kullanarak laboratuvarlar boyunca ve mutant farelerde çeşitli suşları davranış fenotipleri karşılaştırmalar için kullanılan protokol standardizasyonu sağlayan, deneysel prosedürleri daha iyi anlaşılmasını değerlendirdi teşvik edecektir. Daha önce açık / koyu geçiş testi (Takao ve Miyakawa, 2006a) bir film protokol yayınlamıştır. Aynı şekilde, açık alan testi gibi diğer protokoller, film, porsolt yüzmeye testi zorla ve davranışsal test bataryası kullanmak korku klima testleri halen gelecek video dergi makaleleri gibi yayın yapılıyor.
Disclosures
Tüm işlemler, Kyoto Üniversitesi Hayvan Kullanım ve Bakım Komitesi tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Bu araştırma tarafından desteklenen Hibeler Bilim Teşvik (JSP'ler) Hibe Yardım, Milli Eğitim Bakanlığı, Japonya Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Burslar-Japonya Derneği Bilimsel Araştırma Yardım KUŞ ve CREST Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı, Sinirbilim Japonya Merkezi (NIJC), RIKEN Öncelikli Alanlar-Bütünleştirici Beyin Araştırmaları (SHIEN) Bilimsel Araştırma Hibe Yardım ve Hibe Yardım Yardım içinde MEXT gelen Japonya. Biz bu filmi oluşturarak O'hara & Co ve Mariko Hayashi, yardım için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Elevated plus maze | Tool | O’hara Co. | (none) |
References
- Takao, K., Miyakawa, T. Light/dark transition test for mice. J Vis Exp. , (2006).
- Aiba, A. Mouse liaison for integrative brain research. Neurosci Res. 58, 103-104 (2007).
- The knockout mouse project. Nat Genet. 36, 921-924 (2004).
- Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann N Y Acad Sci. 1086, 144-159 (2006).
- Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotyping of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci Res. 58, 124-1232 (2007).
- Crawley, J. N. What's Wrong With My Mouse? Behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , 2nd edition, John Wiley and Sons. New York. 240 (2007).
- Rodgers, R. J., Dalvi, A. Anxiety, defense and the elevated plus-maze. Neurosci Behav Rev. 21, 801-810 (1997).
- Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 324, 1-5 (1984).
- Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. J Neurosci Meth. 14, 149-167 (1985).
- File, S. E., Pellow, S. The effects of triazolobenzodiazepines in two animal tests of anxiety and in the holeboard. Br J Pharmac. 86, 729-7235 (1985).
- Lister, R. G. The use of a plus-maze to measure anxiety in the mouse. Psychopharmacology. 92, 180-185 (1987).
- Miyakawa, T., Yagi, T., Kagiyama, A., Niki, H. Radial maze performance, open-field and elevated plus-maze behaviors in Fyn-kinase deficient mice: further evidence for increased fearfulness. Brain Res Mol Brain Res. 37, 145-150 (1996).
- Manabe, T. Loss of cadherin-11 adhesion receptor enhances plastic changes in hippocampal synapses and modifies behavioral responses. Mol Cell Neurosci. 15, 534-546 (2000).
- Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
- Seeger, T. M2 muscarinic acetylcholine receptor knockout mice show deficits in behavioral flexibility, working memory, and hippocampal plasticity. J Neurosci. 24, 10117-10127 (2004).
- Morishima, Y. Enhanced cocaine responsiveness and impaired motor coordination in metabotropic glutamate receptor subtype 2 knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA. 102, 4170 (2005).
- Miyamoto, T. Tight junctions in Schwann cells of peripheral myelinated axons: a lesson from claudin-19-deficient mice. J Cell Biol. 169, 527-538 (2005).
- NFAT dysregulation by increased dosage of DSCR1 and DYRK1A on chromosome 21. Nature. 441, 595-600 (2006).
- Hattori, S. Enriched environments influence depression-related behavior in adult mice and the survival of newborn cells in their hippocampi. Behav Brain Res. 180, 69-76 (2007).
- Niemann, S. Genetic ablation of NMDA receptor subunit NR3B in mouse reveals motoneuronal and non-motoneuronal phenotypes. Europ J Neurosci. 26, 1407-1420 (2007).
- Sano, H., Nagai, Y., Miyakawa, T., Shigemoto, R., Yokoi, M. Increased social interaction in mice deficient of the striatal medium spiny neuron-specific phosphodiesterase 10A2. J Neurochem. 105, 546-556 (2008).
- Horii, Y., Yamasaki, N., Miyakawa, T., Shiosaki, S. Increased anxiety-like behavior in neuropsin (kallikrein-related peptidase 8) gene-deficient mice. Behav Neurosci. 122, 498-504 (2008).
- Fukuda, E. Down-regulation of protocadherin-α, A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur J Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Ikeda, M. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Behav Neurosci. , In Press Forthcoming.
- Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. Eur J Phamacol. 463, 163-175 (2003).
- Hogg, S. A review of the validity and variability of the elevated plus-maze as an animal model of anxiety. Pharmacol Biochem Behav. 54, 21-30 (1996).
- Holmes, A., Parmigiani, S., Ferrari, P. F., Palanza, P., Rodgers, R. J. Behavioral profile of wild mice in the elevated plus-maze test for anxiety. Physiol Behav. 71, 509-516 (2000).
- Tsujimura, A., Matsuki, M., Takao, K., Yamanishi, K., Miyakawa, T., Hashimoto-Gotoh, T. Mice lacking the kf-1 gene exhibit increased anxiety- but not despair-like behavior. Front. Behav. Neurosci. 10, In Press (2008).
- Nakajima, R., Takao, K., SM, H. uang, Takano, J., Iwata, N., Miyakawa, T., Saido, T. C. Comprehensive Behavioral Phenotyping of Calpastatin-Knockout Mice. Molecular Brain. , In Press Forthcoming.
- Miyakawa, T. Conditional calcineurin knockout mice exhibit multiple abnormal behaviors related to schizophrenia. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 8987-8992 (2003).
- Factor analyses of large-scale data justify the behavioral test battery strategy to reveal the functional significances of the genes expressed in the brain. Yamasaki, N. The 36th Annual Meeting of the Society for Neuroscience, 2006 October 14–18, Atlanta, Georgia, , Program number 100.15, Poster Number PP32 (1985).
- Crabbe, J. C., Wahlsten, D., Dudek, B. C. Genetics of mouse behavior: interactions with laboratory environment. Scienc. 284, 1670-1672 (1999).
