Summary
Dans ce protocole, nous démontrons comment fabriquer une gamme de micro-disque pour les maladies chroniques des enregistrements électrophysiologiques chez le rat.
Abstract
L'enregistrement chronique de larges populations de neurones est une technique intéressante pour étudier la fonction des circuits neuronaux chez les rats éveillés se comporter. Appareils d'enregistrement léger transportant une gamme haute densité de tétrodes permettre le contrôle simultané de l'activité de dizaines à des centaines de neurones individuels. Nous décrivons ici un protocole pour la fabrication d'une gamme de micro-disque avec vingt un indépendamment meubles micro-disques. Cet appareil a été utilisé avec succès pour enregistrer à partir de neurones de l'hippocampe et le cortex dans notre laboratoire. Nous montrons comment préparer une coutume conçue, imprimée en 3-D base en plastique qui contiendra les disques micro-. Nous démontrons comment construire l'individu micro-disques et comment assembler les complète de micro-disque de tableau. Préparation supplémentaire de la matrice de disque pour l'implantation chirurgicale, comme la fabrication de tétrodes, le chargement des tétrodes dans le tableau d'entraînement et de dorure, est abordée dans un article la vidéo suivante.
Protocol
- Aperçu gamme Micro-drive
Une complète de micro-array disque est constitué de plusieurs composantes principales (Fig. 1):- Un ordinateur conçu la base en plastique qui détient 21 mobiliers indépendamment des micro-disques.
- Une canule au fond de la base dans laquelle un ensemble de tubes de guidage stationnaires tétrode sont collectées.
- 21 micro-disques qui portent chacun une tétrode et qui peut être conduit individuellement à l'aide d'une vis.
- Une carte d'interface électrode pour l'interconnexion entre tétrodes et pré-amplificateurs.
- Un cône de protection (non représenté dans la figure 1.)
- Dans un entièrement assemblé micro-disque de tableau, la base en plastique détient tous les disques micro-. Chaque disque porte un micro-tétrode unique. La tétrode est relié électriquement à la carte d'interface électrode dans le haut du tableau des micro-disque, et traverse le tube de guidage fixes pour la sortie vers le cerveau dans le bas du tableau des micro-disque. En tournant la vis sur chaque disque de micro-avancées ou se rétracte la tétrode.
- Conception de base en plastique
Nous concevons la base d'assemblage du lecteur de micro-dans un paquet en 3-D logiciel de CAO (SolidWorks). L'avantage de ce processus de conception en interne est une rotation rapide et la flexibilité de conception. Dans le laboratoire de Wilson, nous avons conçu de nombreuses variantes de cette partie, orientée vers les exigences spécifiques de chaque expérience. Le fichier modèle 3-D est envoyé à un bureau de service où il est imprimé à partir d'une résine liquide laser guérissables par stéréolithographie. Le délai d'exécution est aussi peu que 2 jours. La pièce obtenue est léger, réutilisable et peut être usiné à tenir qu'à un fil. Dans ce protocole, nous allons utiliser une base d'entraînement qui est conçu avec un site d'enregistrement unique et qui détient 21 des micro-disques. Le fichier de conception SolidWorks est disponible sur demande. - Préparation de base en plastique
La base en plastique est transformé pour accueillir les disques micro-et les vis pour fixer la carte d'interface électrode et le cône de protection. Il n'est pas possible de fiabilité de l'impression en douceur à travers les trous dans la base de plastique, de sorte que nous concevons des trous trop petits, puis les étendre par forage. Alignez soigneusement la mèche avec l'axe du trou de forage existant avant à très basse vitesse. Une perceuse à main à vitesse variable / couple fonctionne bien pour cette tâche.- Percez les trous 21 pour le lecteur de micro-vis (l'anneau extérieur) en utilisant une mèche # 61.
- Percez les 21 trous pour les tubes en charge le lecteur de micro-(la bague intérieure) en utilisant une mèche # 65.
- Percez les trous qui seront utilisées pour attacher le conseil interface électrode et le cône de protection en utilisant un petit 1,55 mm.
- Presse adapter un manchon (5 mm de long 20 Ga paroi mince tube d'acier inoxydable) dans chaque de la bague intérieure de trous à l'aide d'une pincette ou d'une paire de pinces pour qu'il affleure à la base en plastique. Les manches d'assurer une circulation fluide des tubes en charge le lecteur de micro-.
Ensuite, tous les trous qui contiendra les vis sont sur écoute. En plastique imprimé, autotaraudeuses résultat robinets dans plus durables que les discussions typiques de filetage des robinets. Ce style de robinet exige trous plus grands. Utiliser un étau broches à main pour tenir le robinet: - Appuyez sur le trou pour le lecteur de micro-vis à l'aide d'un robinet qui correspond à la taille de vis utilisées (M1.2x0.25) et un lubrifiant sec. Pour aider à aligner le robinet avec le trou pilote, insérez une longueur de 23 tubes de Ga dans le manchon à côté d'elle.
- Notre conception de base en plastique doté d'un démarreur robinet pour chaque trou de vis micro-disque pour s'assurer que les fils initiaux ne sont pas endommagés pendant le processus d'enfilage. Après tous les trous sont filetés, ces démarreurs du robinet peut être facilement cassé net à l'aide d'une lame de rasoir.
- Appuyez sur le trou qui va contenir le vis pour la carte d'interface électrode et le cône de protection à l'aide d'un robinet 1-72.
- L'insertion de tubes de guidage d'électrode
- Pour rendre la canule qui détient tous les tubes de guidage stationnaires d'électrode, couper un morceau de 1,5 cm de long sur 13 tubes en acier inoxydable et Ga poncer la surface avec une roue de meulage Dremel pour améliorer l'adhérence par le acryliques dentaires.
- Insérer cette canule dans le trou au fond de la base en plastique, vérifiez qu'il est co-linéaire avec l'axe vertical du lecteur, et fixez-le avec de l'acrylique dentaire ou époxy. Laisser 5 à 7 mm de la canule exposés afin de faciliter l'implantation chirurgicale.
- Couper les tubes de guidage 21 stationnaires d'électrode (flexible polyimide tubes, diamètre intérieur: 0.0071 ", diamètre extérieur: 0.0116") avec une lame de rasoir pour une longueur de 6 cm.
- Nourrissez les tubes guides un à la fois dans les manches au dessus de la base de disque et tout le chemin à travers la canule collecteur à la base. Vérifier visuellement Kinks ou excessive des tubes de flexion et de la remplacer si nécessaire. Afin de faciliter l'insertion et l'alignement parallèle des tubes de guidage tétrode, on peut commencer avec la première alimentant le paquet entier de 21 tubes de guidage dans la placecanule collecteur d'en bas. Puis, un à la fois, retirer un tube de guidage du faisceau et l'alimenter à partir du haut de la base en plastique dans le trou qui l'a laissée dans le bundle.
- Poussez les tubes de guidage jusqu'à ce qu'ils ne s'étendent que 1-2 mm du haut de la base en plastique. Appliquez une petite quantité de colle cyanoacrylate mince pour les tubes à leur sortie de la canule collecteur, en faisant attention à ne pas laisser n'importe quel flux de colle jusqu'à la fin dans des tubes de guidage.
- Utilisez une lame de rasoir propre pour couper l'excédent de l'ensemble des tubes de guidage au fond du collecteur de la canule.
- La fabrication des micro-disques
Chaque lecteur de micro-constitué d'une vis sur mesure usinées et un tube de support creux (fig. 2). La vis et le tube de support sont attachés ensemble de telle sorte que d'une lèvre sur la vis est intégré à l'acrylique, en laissant la vis de tourner librement (figure 2B). La vis est vissé dans le socle en plastique, et le tube de support est alors entraînée vers le haut ou le bas lorsque la vis est tournée, l'avancement ou de rétracter la tétrode qu'il transporte. Pour plus de facilité de l'ajustement sur l'animal de se comporter, la tête de la vis est en forme de demi-cylindre. Faire un tournevis sur mesure pour cette vis:- Coupez 5 cm de tube 15 Ga en acier inoxydable.
- Prenez l'une des vis sur mesure et meuler les lèvres saillantes.
- Insérez la vis dans le tube jusqu'à ce que le haut de la vis affleure le bout du tuyau.
- Crush le tube autour du filetage à plusieurs reprises avec une paire de pinces de verrouillage afin que la vis ne peut pas tourner par rapport à la canule.
- Utilisez un étau pour maintenir la tige tournevis personnalisés.
Pour fabriquer les disques micro-nous utiliser un moule en 3-D imprimés en plastique avec de petits puits (3 mm x 5 mm, 2 mm de profondeur). Chacun a bien deux trous dans la surface inférieure, espacées de 2 mm, pour le tube de support et la vis. Sinon, les moules peuvent être fabriqués à partir d'un plastique technique comme le Delrin, en utilisant une perceuse à colonne pour créer le bien et des trous. - Préparer le moule en effaçant le trou pour la canule en charge l'utilisation d'une aiguille 23 Ga et tapant sur le trou de la vis comme décrit pour la base en plastique, au-dessus.
- Tapissent l'intérieur du puits avec du lubrifiant téflon ou un film mince de gelée de pétrole pour permettre la libération de l'acrylique guéri dentaires du moule ..
- Appliquer du lubrifiant téflon à une vis et insérez-la dans le moule à l'aide du tournevis sur mesure jusqu'à ce que le fils sont juste en dessous du fond du puits.
- Dépolir le haut 2-3 mm d'un tube de support 14 mm de long (23 tubes de Ga acier inoxydable) avec une meule pour améliorer l'adhérence de l'acrylique dentaire. Insérez-la dans le moule jusqu'à la partie supérieure de la canule est à mi-chemin entre le haut du puits et le haut de la vis.
- Verser acryliques dentaires dans le puits. Le mouvement d'agitation est utilisé pour s'assurer que les acryliques dentaires flux dans tous les espaces autour de la vis et le tube de support. Retirer les bulles d'air avec une petite aiguille.
- Attendez jusqu'à ce que l'acrylique dentaire est complètement guéri (15-30 minutes), puis retirez le disque de micro-du moule en tournant la vis contre-aiguilles d'une montre.
- Il est important de faire une vérification de la qualité des lecteurs de micro-. Inspectez l'acrylique guéri de soins dentaires pour les fissures et / ou des bulles d'air, qui sont généralement causées par l'acrylique dentaire qui était trop épais ou trop mince. Aussi, assurez-vous que les vis et le tube de support sont parallèles les uns aux autres et que la vis tourne en douceur. Vis et tubes de soutien des micro-disques qui ne répondent pas à ces critères peut être craqué libre de l'acrylique dentaire et recyclés.
- Répétez les étapes 5.6 à 5.11 jusqu'à ce que vous avez 21 micro-disques.
- L'assemblage final des micro-array disque
- Basse chaque disque micro-disque dans la base en plastique. Chaque tube de support micro-disque doit se déplacer régulièrement à l'intérieur de sa manche et sur son tube de guidage stationnaire. Assurez-vous que les tubes de guidage ne se tord pas que le lecteur de micro-est abaissé.
- Avec les disques micro-complètement abaissé, ajouter une fine couche d'acrylique dentaire à l'intérieur de la base d'entraînement pour fixer les tubes de guidage d'électrode en place.
- Notez que l'échec à la baisse les disques micro tout le chemin avant d'ajouter l'acrylique dentaires se traduira par capillarité de l'acrylique tout le chemin jusqu'à l'obstruction des manches et des micro-disque mouvement.
- Étiqueter les micro-disques 1-21.
- Tourner la baie de disques à l'envers et prendre une photo du faisceau de tubes de guidage. Cette image sera utilisée pour cartographier l'emplacement du tube guide correspondant à chaque lecteur de micro-.
- Lever tous les disques micro-par plusieurs mm.
- Insérer un polyimide tube porteur (0,005 ") dans chaque tube de guidage à partir du bas de la base d'entraînement. Laisser le tube porteur d'étendre à 1-2 mm du haut de la fiche complètement abaissé micro-lecteur et sur la photographie et de l'identité de la correspondante de micro-disque.
- Collez lestube porteur dans le tube d'appui aux micro-lecteur à l'aide de 5 minutes époxy ou colle cyanoacrylate. Notez que la colle époxy ou qui est trop mince couler la canule de soutien et d'entraver le mouvement libre de la micro-voiture ou, pire, le fixer à la canule guide. Si cela arrive, que des micro-disque unité ne peut pas être utilisé.
- Abaisser complètement tous les disques micro-. Couper tous les tubes support au ras dans le bas de la canule collecteur à l'aide d'une lame de rasoir propre.
- Enfin, montez le conseil d'électrode Neuralynx interface à la base d'entraînement à l'aide de deux vis (taille: 1-72, longueur: 3 / 16 ").
À ce stade du tableau lecteur est prêt à être chargé avec tétrodes. Fabrication de tétrodes, comment les charger dans le micro-disques, et comment préparer le tableau d'entraînement pour l'implantation chirurgicale sont les sujets d'un article de la vidéo suivante.
Figure 1. Modèle de produits finis de micro-disque de tableau. Une matrice de micro-disque se compose de plusieurs éléments majeurs: une base d'entraînement en plastique; une canule collecteur à partir de laquelle l'tétrodes pénétrer dans le cerveau; 21 micro-disques que chaque lecteur une tétrode unique; une carte d'interface électrode qui se connecte au pré-amplificateurs.
Figure 2. Personnalisé micro-disque vis. A. dessins techniques de la conception à vis personnalisés. La vis comporte une partie filetée (M1.2x0.25; 1,2 mm de diamètre, 0,25 mm / tour)., Une tête de demi-cylindre qui correspond à notre pilote personnalisé vis de fait et une partie lisse avec la lèvre (voir détail) B. Modèle de complète de micro-disque. Le tube de support et de vis sur mesure sont connectés avec du ciment dentaire. La lèvre sur la vis est intégré dans le ciment dentaire et permet une rotation libre pendant la conduite du tube de support vers le haut ou vers le bas.
Fichiers supplémentaires
Nous avons conçu la base d'entraînement imprimé, le cône de protection et le moule pour la construction de la micro-disques dans le logiciel SolidWorks 2008 CAO 3D:
- Télécharger le fichier: DriveBase.sldprt qui contient des modèles de la base de disque et le cône de protection et une casquette.
- Télécharger le fichier: MicroDriveMold.sldprt qui contient le modèle du moule micro-disque
Le bureau du service d'impression 3D ne peut pas manipuler les fichiers natifs SolidWorks directement, mais exige plutôt les fichiers de conception en stéréolithographie format CAO (STL). Pour les personnes qui n'ont pas accès au logiciel Solidworks, mais toujours voudrait utiliser les pièces d'imprimés utilisés dans l'article la vidéo nous incluons les dessins au format STL ainsi:
- Télécharger le fichier: DriveBase.stl qui contient le modèle de base d'entraînement
- Télécharger le fichier: MicroDriveMold.stl qui contient le modèle de micro-disque moisissures
- Télécharger le fichier: ProtectionCap.stl qui contient le modèle de bouchon pour cône de protection
- Télécharger le fichier: ProtectionCone.stl qui contient le modèle de cône de protection
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ce protocole décrit les caractéristiques générales du processus de construction de micro-disque. Il a été modifié avec succès pour produire des tableaux d'entraînement avec des objectifs multiples d'enregistrement ou de petits tableaux pour les enregistrements chez la souris. En plus de l'enregistrement de l'hippocampe, de nombreux chercheurs utilisent ces disques de cibler les structures corticales et sous corticales. L'utilisation de vis plus longues peuvent être nécessaires afin d'enregistrer à partir de structures cérébrales profondes. Avec modification importante à la base d'entraînement, motorisé conduit mon être utilisé en lieu et place de celles manuellement tourné, permettant plus précise, l'ajustement tétrode à distance (Yamamoto et Wilson, 2008). Personnalisé stationnaire arrangements canule guide ont été utilisées à la place de la canule principale circulaire pour obtenir un contrôle sur la distribution spatiale des tétrodes dans le cortex et l'hippocampe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Linus D. Soleil et Jeenah Jung, qui a lancé l'utilisation de l'ordinateur conçu, en 3-D des lecteurs imprimées dans notre laboratoire pour l'enregistrement de la souris. En outre, nous tenons à remercier tous les membres passés et présents Lab Wilson pour leur contribution à la micro-disque et le développement technologique tétrode dans le laboratoire.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
