Summary
В этом протоколе мы показали, как для изготовления микро-дисков массива при хронических электрофизиологических записей у крыс.
Abstract
Хронический записи больших популяций нейронов ценный метод для изучения функции нейронных цепей в себя бодрствовать крыс. Легкий записывающих устройств проведении высокой плотностью массива тетроды позволяют одновременный мониторинг активности в десятки и сотни отдельных нейронов. Здесь мы опишем протокол для изготовления микро-диска массив с двадцать один самостоятельно подвижных микро-диски. Это устройство было успешно используется для записи с гиппокампа и коры нейроны в нашей лаборатории. Мы покажем, как готовить специально созданных, 3-D печатных пластиковая основа, которая будет содержать микро-диски. Мы демонстрируем, как строить отдельные микро-дисков и, как собрать полный микро-диск массива. Дальнейшая подготовка дисков массива для хирургической имплантации, такие как изготовление тетродов, загрузка тетроды в массив диск и позолотой, кроется в следующей статье видео.
Protocol
- Микро-диск массива обзор
Полный микро-дисков массива состоит из нескольких основных компонентов (рис. 1):- Компьютер, созданный пластиковая основа, которая содержит 21 независимо друг от друга подвижных микро-диски.
- Канюля в нижней части базы, в которой множество стационарных труб руководство тетрод собирается.
- 21 микро-диски, которые несут один тетрод, и которые могут быть индивидуально движется в винт.
- Доска электрод для соединения между тетроды и предварительных усилителей.
- Защитный конус (не показаны на рис. 1)
- В полностью собранном микро-диск массива, пластиковая основа содержит все микро-диски. Каждая микро-привод влечет за один тетрод. Тетрод электрически соединен с интерфейсной платы электрода в верхней части микро-диск массива, и проходит через трубку стационарного руководство, чтобы выйти к мозгу в нижней части микро-дисков массива. Поворот винта на каждом микро-привод авансов или втягивается тетрод.
- Дизайн пластиковой основе
Мы создаем базу сборки микро-диска в 3-D CAD пакета программ (SolidWorks). Преимущество этого внутреннего процесса проектирования является быстрый оборот и гибкости дизайна. В Уилсон лаборатории мы разработали множество вариантов этой части, направлены на специфические требования каждого эксперимента. 3-D модель файл отправляется в сервис-бюро, где он напечатал от лазерной излечимых жидкой смолы использования стереолитографии. Срок оформления составляет всего 2 дня. В результате часть легкого, повторного использования и могут быть обработаны держать нити. В этом протоколе мы будем использовать диск база, которая разработана с одного сайта записи и который содержит 21 микро-диски. Файл SolidWorks дизайн выполнен предоставляется по запросу. - Подготовка пластиковой основе
Пластиковая основа обрабатывается для размещения микро-диски и винта, чтобы прикрепить плату электрод и защитный конус. Это не возможно надежно печати гладкой через отверстия в пластиковой основе, поэтому мы разрабатываем низкорослых отверстия, а затем расширить их бурения. Тщательно выровняйте сверло с осью существующей дыры, прежде чем бурение на очень низкой скорости. Переменной скоростью / моментом ручная дрель работает хорошо для этой задачи.- Дрель 21 отверстий пилот микро-диска винта (внешнее кольцо), используя # 61 бит.
- Дрель 21 отверстий для микро-диск поддержки труб (внутреннее кольцо), используя # 65 бит.
- Просверлите отверстия, которые будут использоваться для подключения платы электрод и защитный конус использованием 1,55 мм бит.
- Пресс подходят рукава (5 мм длиной 20 Ga тонкими стенками трубы из нержавеющей стали) в каждую из внутреннего кольца отверстий использованием пинцетом или плоскогубцами так, чтобы она была вровень с пластиковой базой. Рукава обеспечить беспрепятственное движение микро-привод труб поддержки.
Далее, все отверстия, которые будет проводить винтами прослушиваются. В печатных пластмассы, нитки формирования результате кранов в более долговечны, чем обычные темы для нарезания резьбы краны. Этот стиль водопроводной требует больших отверстий пилота. Использование ручной контактный тиски провести нажмите: - Нажмите отверстия для микро-диск винты с помощью крана, который соответствует винт с используемым форматом (M1.2x0.25) и сухой смазки. Чтобы помочь выровнять кран с пилотное отверстие, вставьте длиной 23 трубки Ga в рукав рядом с ним.
- Наши пластиковые базовой конструкции функции крана стартер для каждого микро-диска винта отверстие, чтобы убедиться, начальный темы не были повреждены во время потоками процесса. В конце концов отверстия с резьбой, эти стартеры крана может быть легко отхватили использованием лезвия бритвы.
- Нажмите отверстия, которые будет проводить винты для платы электрод и защитный конус использованием 1-72 крана.
- Размещение труб электрода руководство
- Для того, чтобы канюля, который содержит все стационарные трубы руководство электрода, нарезать 1,5 см длиной кусок 13 Ga трубы из нержавеющей стали и шероховатой поверхности с Dremel шлифовального круга для повышения сцепления в стоматологических акриловых.
- Вставьте эту канюлю в отверстие в нижней части пластиковой основе, убедитесь, что он является одним из линейной вертикальной оси диска, и закрепите ее с зубной акриловой или эпоксидной смолы. Оставьте 5 до 7 мм канюлю подвергается облегчить хирургической имплантации.
- Вырезать 21 стационарных электродов направляющих труб (гибкие полиимидные труб, внутренний диаметр: 0,0071 ", наружный диаметр: 0,0116") с лезвием длиной до 6 см.
- Поток направляющих труб по одному в рукава в верхней части базы диск и на всем пути через коллектор канюли в нижней части. Визуально проверьте для перегибов или чрезмерного изгиба трубы и заменить при необходимости. Для облегчения установки и выравнивания параллельных труб тетрод руководство, можно начать с первого кормления весь комплект из 21 труб руководство вверх вколлектор канюли снизу. Затем, один за один раз, удалить направляющую трубу из комплекта и кормить его из верхней части пластиковой основе через отверстие, которое он оставил в связке.
- Нажмите направляющие трубы, пока они распространяются только 1-2 мм от верхней части пластиковой основе. Нанесите небольшое количество тонких цианоакрилат клей для труб при выходе коллектора канюли, стараясь не оставлять на ней клей поток вверх в конце направляющих труб.
- Использование свежей лезвие, чтобы отрезать от избыточного пучок направляющих труб на дне коллектора канюли.
- Изготовление микро-диски
Каждая микро-диск состоит из специально обрабатывается винт и полая трубка поддержки (рис. 2). Винт и опорной трубки крепятся вместе так, что губы на винт встроен в акрил, оставив винт свободно вращаться (рис. 2В). Винт вкручивается в пластиковой основе, и трубка затем приводом вверх или вниз, когда винт включен, продвижение или втягивания тетрод, что он несет. Для облегчения настройки на поведение животных, глава винт в форме полуцилиндра. Сделать пользовательские отвертка для этого винта:- Отрежьте 5 см от 15 Ga трубы из нержавеющей стали.
- Возьмите одну из пользовательских винты и стачиваются выступающие губы.
- Вставьте винт в трубку до верхней части винта на одном уровне с конца трубы.
- Давка трубки вокруг резьбы неоднократно с парой замок плоскогубцами так, что винт не может вращаться относительно канюли.
- Использование контактных тиски провести специальный драйвер винта.
Для изготовления микро-дисков мы используем 3-D печатных пластиковые формы с небольшими скважин (3 мм х 5 мм, 2 мм в глубину). Каждая скважина имеет два отверстия в нижней поверхности, расстояние между которыми 2 мм друг от друга, для трубки поддержки и винт. Кроме того, формы могут быть изготовлены из инженерный пластик, как Delrin, используя сверлильный станок для создания хорошо и дырок. - Подготовка пресс-формы, очистив отверстие для поддержки использования канюли 23 Ga иглы и постукивая отверстие для винта, как описано для пластиковой основе, выше.
- Линия внутри хорошо с тефлоновой смазки или тонкий слой вазелина, чтобы обеспечить выпуск вылечить стоматологических акриловых из формы ..
- Применение тефлоновой смазки на винт и вставьте его в форму использования на заказ отверткой, пока нити чуть ниже дна колодца.
- Шероховатым верхней 2-3 мм 14 мм длиной опорной трубки (23 Ga нержавеющих стальных труб) с шлифовального круга для повышения адгезии стоматологических акриловых. Вставьте его в форму до верхней части канюли находится на полпути между верхней части колодца и верхней части винта.
- Налейте стоматологических акриловых в колодец. Агитацию движения используется, чтобы гарантировать, что стоматологических акриловых потоки во все места вокруг винта и поддержки трубки. Удалите пузырьки воздуха с небольшой иглы.
- Подождите, пока стоматологических акриловых полностью вылечить (15-30 минут), а затем удалить микро-диск из формы, вращая винт против часовой стрелки.
- Важно, чтобы сделать проверки качества микро-диски. Осмотрите вылечить стоматологических акриловых на наличие трещин и / или пузырьков воздуха, которые обычно вызваны стоматологических акриловых, который был слишком толстым или слишком тонким. Также убедитесь, что винт и опорной трубки расположены параллельно друг другу, и оборотов винта гладко. Винты и несущих трубах микро-диски, которые не отвечают этим критериям, могут быть взломаны свободным от стоматологических акриловых и переработаны.
- Повторите шаги с 5,6 по 5,11 пока у вас есть 21 микро-диски.
- Окончательная сборка микро-дисков массива
- Нижняя каждый микро-диск на пластиковой основе диска. Каждая микро-диск поддержки трубка должна плавно перемещаться как внутри, так его рукав и за ее стационарной трубки руководства. Убедитесь, что направляющие трубы не пряжкой, как микро-диск в настоящее время снижается.
- С микро-диски полностью снижена, добавьте тонкий слой зубной акриловый внутрь диска базы исправить труб электрода руководство на месте.
- Обратите внимание, что неудача в нижней микро-диски на всем пути, прежде чем добавлять стоматологических акриловых приведет влагу из акрилового все, вплоть до рукавов и препятствование микро-привод движения.
- Этикетка микро-диски 1-21.
- Поверните диск массива с ног на голову и сфотографировать пучок направляющих труб. Эта картина будет использоваться для отображения местоположения направляющей трубки, соответствующие каждой микро-привод.
- Поднимите все микро-диски в несколько мм.
- Вставьте полиимида перевозчика трубки (0,005 ") в каждую направляющую трубу со дна диска базы. Пусть носитель трубки расширить 1-2 мм от верхней части полностью опущенном микро-диск и и запись на фотографии личность соответствующее микро-привод.
- КлейПеревозчик трубки микро-привод трубка использованием 5-минутный эпоксидный клей или цианоакрилат. Обратите внимание, что клей или эпоксидную, который является слишком тонким будет стекать поддержки канюли и препятствуют свободному движению микро-диск или, хуже того, чтобы исправить ее руководство канюли. Если это произойдет, что особенно микро-привод не может быть использована.
- Полностью опустить все микро-диски. Вырезаны все трубы перевозчика от флеша на дне коллектора канюли с использованием свежей лезвие бритвы.
- Наконец, установите Neuralynx интерфейсной платы электрода диск базу с помощью двух винтов (размер: 1-72, длина: 3 / 16 ").
На данный момент диск массива готова быть загружены с тетроды. Изготовление тетроды, как загрузить их в микро-дисков, и как подготовить диск массива для хирургической имплантации являются субъектами следующей статье видео.
Рисунок 1. Модель готовой микро-дисков массива. Микро-диска массив состоит из нескольких основных компонентов: пластиковая основа диска; коллектор канюли из которой тетроды проникать в мозг, 21 микро-дисков, каждый диск один тетрод; борту электрод, который подключается к предварительных усилителей.
Рисунок 2. Custom микро-диска винта. А. Технические рисунки индивидуальный дизайн винта. Винт имеет резьбовой части (M1.2x0.25; 1,2 мм, 0,25 мм / ход)., Половину головки цилиндра, что соответствует нашему заказу отвертки и гладкой части с губ (см. подробности) B. Модель полный микро-привод. Трубка поддержки и пользовательские винт связаны с зубным цементом. Губу на винт встроен в стоматологического цемента и позволяет свободное вращение во время вождения трубка вверх или вниз.
Дополнительные файлы
Мы разработали печатных диск база, защитный конус и плесень на строительство микро-диски в SolidWorks 2008 3D CAD программное обеспечение:
- Скачать файл: DriveBase.sldprt который содержит модели базы диск и защитные конуса и крышкой.
- Скачать файл: MicroDriveMold.sldprt которая содержит модель микро-привод плесень
3D-бюро службы печати не может справиться с родной файлы Solidworks непосредственно, а требует разработки файлов в формате CAD стереолитографии (STL). Для людей, которые не имеют доступа к программному обеспечению Solidworks, но все же хотели бы использовать печатный детали, используемые в видео статью мы включили конструкций в формате STL, а также:
- Скачать файл: DriveBase.stl которая содержит модель базы диска
- Скачать файл: MicroDriveMold.stl которая содержит модель микро-привод плесень
- Скачать файл: ProtectionCap.stl который содержит модели колпачок для защитного конуса
- Скачать файл: ProtectionCone.stl который содержит модели защитного конуса
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает общие черты микро-привод строительного процесса. Она была успешно модифицированы для производства дисков массивов с несколькими целями записи или меньше массивы для записи на мышах. В дополнение к записи от гиппокампа, многие исследователи используют эти диски на целевой коры и подкорковых структур. Использование более длинных винтов может потребоваться для того, чтобы запись из более глубоких структур головного мозга. С обширной модификации дисков базы, моторизованные диски моего использоваться вместо того, чтобы вручную, а ныне те, что позволяет более точно, удаленной настройки тетрод (Yamamoto и Вильсон, 2008). Индивидуальные стационарные механизмы канюли руководства были использованы вместо круговой основных канюли для достижения пространственного контроля над распределением тетроды в коре и гиппокампе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы выразить признательность Линус Д. Солнце и Jeenah Юнг, который инициировал использование компьютерных продуманные, 3-D диски печатаются в нашей лаборатории для записи с мышами. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить всех прошлых и настоящих членов Уилсон Лаборатории за их вклад в микро-привод и тетрод развития технологии в лаборатории.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
