Summary
Bu protokolde sıçanlarda kronik elektrofizyolojik kayıtlar için bir mikro-sürücü dizi nasıl imal göstermektedir.
Abstract
Kronik nöronların büyük nüfus kayıt uyanık davranmak sıçanlarda nöronal devrelerin fonksiyonunu çalışmak için değerli bir tekniktir. Tetrodes yüksek yoğunluklu bir dizi taşıyan Basit kayıt cihazları, onlarca yüzlerce bireysel nöronların aktivitesi eş zamanlı olarak izlenmesi için izin verir. Burada biz, yirmi bir bağımsız hareket edebilen mikro sürücüler ile mikro sürücü dizi imalat için bir protokol açıklar. Bu cihaz laboratuarımızda hipokampal ve kortikal nöronların kaydetmek için başarıyla kullanılmaktadır. Biz nasıl hazırlamak için tasarlanmış özel bir mikro-sürücüler yapacak 3-D baskılı plastik üssü göstermektedir. Biz bireysel mikro diskler nasıl inşa etmek ve mikro sürücü dizi nasıl monte edildiğini göstermektedir. Tetrodes fabrikasyon olarak cerrahi implantasyon için sürücü dizisi ve altın kaplama içine tetrodes yükleme sürücü dizi, daha fazla hazırlık, bir sonraki video makalede kaplıdır.
Protocol
- Micro-sürücü dizi genel bakış
Tam bir mikro-sürücü dizi birkaç ana bileşenleri (Şekil 1) oluşur:- 21 bağımsız hareket edebilen mikro sürücüler tutan plastik taban tasarlanmış bir bilgisayar.
- Sabit tetrode kılavuz tüpleri bir dizi toplanan tabanının alt kısmında bir kanül.
- Her biri tetrode taşıyan ve 21 mikro diskler tek bir vida ile sürülebilir.
- Tetrodes ve pre-amplifikatörleri arasında ara bağlantı için bir elektrot arayüz kartı.
- Koruyucu bir koni (Şekil 1)
- Tamamen monte edilmiş mikro sürücü dizide, plastik taban tüm mikro-sürücüler tutar. Her bir mikro-sürücü tek bir tetrode taşır. Tetrode elektriksel mikro sürücü dizi üst elektrot arabirimi yönetim kuruluna bağlı ve mikro sürücü dizinin alt kısmında beynin doğru çıkmak için sabit kılavuz tüpü geçer. Her bir mikro-sürücü gelişmeler ya da geri çeker tetrode üzerindeki vida açılması.
- Plastik taban tasarımı
Biz bir 3-D CAD yazılım paketi (SolidWorks), mikro-sürücü montaj tabanı tasarımı. Bu in-house tasarım sürecinin avantajı hızlı ciro ve tasarım esnekliği. Wilson laboratuvarda biz bu bölümü pek çok çeşidi, her deney kendine özgü talepleri yönelik tasarladık. 3-D model dosyasını stereolitografi kullanarak lazer tedavi edilebilir bir sıvı reçine baskılı nerede bir hizmet bürosuna gönderilir. Geri dönme süresi en az 2 gündür. Ortaya çıkan kısmı hafif, yeniden ve bir iplik tutmak için işlenebilir. Bu protokol, 21 mikro-sürücüleri tutan tek bir kayıt sitesi ve tasarlanmış bir sürücü tabanı kullanacak. SolidWorks tasarım dosyası, talep üzerine sunulacaktır. - Plastik taban hazırlanması
Plastik taban elektrot arayüz kartı ve koruyucu koni eklemek mikro sürücüler ve vidaları yerleştirmek için işlenir. Bu deliklerden yumuşak plastik taban güvenilir yazdırmak mümkün değildir, bu yüzden onları sondaj tarafından genişletmek, sonra cılız delik tasarımı. Mevcut delik ekseni ile matkap, çok düşük hızda delme önce dikkatlice hizalayın. Bir değişken hız / tork el matkabı, bu görev için iyi çalışır.- # 61 bit kullanarak, mikro-drive vida (dış halka) için 21 pilot delik açın.
- # 65 bit mikro-sürücü desteği tüpleri (iç halka) için 21 delik delin.
- 1.55 mm biti ile elektrot arayüz kartı ve koruyucu koni bağlamak için kullanılan olacak delikler delin.
- Plastik tabanı ile aynı hizada olacak şekilde her bir cımbız veya bir pense kullanarak delikler iç halka içine bir kol (5 mm uzunluğu 20 Ga ince duvarlı paslanmaz çelik borular) uygun basın. Kolları, mikro-sürücü desteği tüplerin düzgün hareket sağlar.
Sonra, vidaları tutun tüm delikleri dokundunuz. Baskılı plastik, tipik iplik kesme musluklar daha dayanıklı konuları parçacığı oluşturan musluklar sonucu. Musluk Bu tarz büyük pilot deliklerini gerektirir. Musluk tutmak için, elde tutulan bir pin mengene kullanma: - Mikro-sürücü vidalar için kullanılan vida boyutu (M1.2x0.25) ve kuru bir yağ ile eşleşen bir musluk kullanarak delikler dokunun. Pilot delik musluk hizalamak yardımcı olmak için, yanındaki kol uzunluğu 23 Ga boru takın.
- Bizim plastik taban tasarımı ilk konuları parçacığı işlemi sırasında zarar görmediğinden emin olmak için her mikro sürücü vida deliği için bir musluk marş sahiptir. Tüm delikleri diziliyor sonra, bu dokunun başlayanlar jilet kullanarak kolayca çıkardı olabilir.
- Elektrot arayüz kartı ve 1-72 musluk kullanarak koruyucu koni vida yapacak delikleri dokunun.
- Elektrot kılavuzu tüplerin yerleştirilmesi
- Tüm sabit elektrot kılavuz tüpleri tutan kanül yapmak için, 13 Ga paslanmaz çelik boru 1.5cm uzunluğunda bir parça kesme ve diş akrilik dremel taşlama ile yüzeye yapışmasını artırmak için pürüzlendirmek.
- Bu kanül plastik taban altındaki deliğe takın, dikey eksen sürücü ile birlikte doğrusal olduğunu doğrulamak ve diş akrilik veya epoksi ile sabitleyin. 5 ile 7 mm kanül cerrahi implantasyon kolaylaştırmak maruz bırakın.
- 6 cm uzunluğunda bir jilet ile 21 sabit elektrot kılavuz tüpleri (: 0,0071 "0,0116, dış çapı" esnek borular, iç çapı poliimid) kesin.
- Kılavuz tüpleri tek kollu sürücü taban ve altındaki kolektör kanül aracılığı ile tüm yol üstündeki bir seferde besleyin. Gerekirse Görme bükülmeler veya aşırı bükülmesi ve yerine tüpler için kontrol edin. Ekleme ve tetrode kılavuz tüpleri paralel uyumu kolaylaştırmak için, bir ilk olarak 21 kılavuz tüpleri tüm desteyi besleme ile başlayabilirsinizaşağıdan kollektör kanül. Sonra, bir defada bir paket, bir kılavuz tüp kaldırmak ve paket geride bıraktığı plastik taban üst delikten onu beslemek.
- Sadece 1-2 mm plastik taban üst çıkıncaya kadar kılavuz tüpler aşağı doğru itin. Kılavuz tüpleri sonuna kadar herhangi bir tutkal akışı girmemesine dikkat ederek, kollektör kanül çıkmak gibi tüpler için küçük bir miktar ince siyanoakrilat yapıştırıcı uygulayın.
- Kollektör kanül altındaki kılavuz tüpleri paket fazlalığı kesmek için yeni bir jilet kullanın.
- Mikro diskler, Fabrikasyon
Her bir mikro-sürücü işlenmiş özel bir vida ve içi boş bir destek tüpü (Şekil 2) oluşur. Vida ve destek tüpü vida (Şekil 2B) serbestçe döndürmek için bırakarak, birlikte, vida bir dudak akrilik gömülü olduğu eklenir. Vidalı plastik üssü haline dişli ve destek tüpü taşıdığı tetrode ilerleyen veya geri çekilmeden sonra, vida açıldığında aşağı yukarı tahrik veya. Davranmak hayvan ayar kolaylığı için, vida kafası yarım silindir şeklinde. Bu vida için özel bir tornavida olun:- 15 Ga paslanmaz çelik boru 5 cm kesin.
- Özel vidalar birini alın ve çıkıntılı dudak eziyet.
- Vida vida hortumun ucu ile aynı hizada kadar tüp içine yerleştirin.
- Vida konuları etrafında boru vida kanül göre döndürmek, böylece kilitleme pense bir çift ile tekrar tekrar ezin.
- Özel tornavida tutmak için bir pin mengene kullanın.
Imal etmek için küçük kuyuları (3 mm x 5 mm, 2 mm derinliğinde) bir 3-D baskılı plastik kalıp kullanmak mikro-sürücüler. Her iyi destek tüpü ve vida, 2 mm arayla alt yüzeyinde iki delik vardır. Alternatif olarak, kalıplar, iyi ve delik oluşturmak için bir matkap basın kullanarak Delrin gibi bir mühendislik plastikten imal edilebilir. - 23 Ga iğne kullanılarak ve yukarıdaki gibi, plastik taban açıklanan vida için delik dokunarak destek kanül delik temizleyerek kalıp hazırlayın.
- Teflon kalıp tedavi diş akrilik serbest bırakılması için izin yağ ya da ince bir tabaka vazelin ile kuyunun içine Hattı ..
- Bir vida teflon yağlayıcı ve konuları sadece iyi alt altındadır kadar özel yapılmış tornavida kullanarak kalıp içine yerleştirin.
- Diş akrilik yapışmasını geliştirmek için bir taşlama ile, 14 mm uzunluğunda destek tüpünün üst 2-3 mm (23 Ga paslanmaz çelik borular) pürüzlendiriniz. Kanül üst yarıya iyi üst ve üst vida arasında kadar kalıp içine yerleştirin.
- Kuyunun içine diş akrilik dökün. Süzme hareket akrilik diş vida ve destek tüpü çevresindeki tüm alanlarda akar sağlamak için kullanılır. Küçük bir iğne ile herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın.
- Diş akrilik tamamen tedavi olana kadar bekleyin (15-30 dakika) ve daha sonra, saat yönünün tersine bilge vida çevirerek kalıptan mikro-sürücüyü çıkarmak.
- Mikro sürücüler bir kalite kontrol yapmak önemlidir. Genellikle çok kalın veya çok ince bir diş akrilik neden olduğu çatlak ve / veya hava kabarcıkları, tedavi için diş akrilik inceleyin. Ayrıca, vida ve destek tüpü birbirine paralel ve vida sorunsuz çalıştığından emin olun. Bu kriterlere uymayan mikro sürücüler Vida ve destek tüpler, diş akrilik ve geri dönüşümlü ücretsiz kırık olabilir.
- 21 mikro-sürücüler kadar bu işlemi tekrarlayın 5.11 ile 5.6 adım.
- Mikro-sürücü dizinin son montaj
- Her bir mikro-sürücü, plastik sürücü üssü haline indirin. Her bir mikro-sürücü destek tüpü ile kol iç ve sabit kılavuz tüpü üzerinde düzgün bir şekilde hareket etmelidir. Mikro sürücü alçaltılmış olarak kılavuz tüpleri toka olmadığını emin olmak için kontrol edin.
- Mikro sürücüleri tamamen indirdi yerinde elektrot kılavuzu tüpleri düzeltmek için sürücü tabanının iç diş akrilik ince bir tabaka ekleyin.
- Akrilik mikro sürücü hareketi kollu ve obstrüksiyon kadar tüm yol esneklik içinde tüm diş akrilik eklemeden önce mikro sürücüler düşük başarısızlık neden olacağını unutmayın.
- Mikro sürücüler 1-21 Etiket.
- Sürücü dizisi baş aşağı çevirin ve kılavuz tüpleri demetinin bir resim çekmek. Bu resim, her bir mikro-sürücü karşılık gelen kılavuz tüp yerini eşlemek için kullanılır olacaktır.
- Birkaç mm tüm mikro-sürücüler kaldırın.
- Bir sürücü tabanının altındaki her kılavuz tüp içine taşıyıcı tüp (0.005) poliimid yerleştirin. Taşıyıcı tüp fotoğraf tamamen düşürdü mikro sürücü ve kayıt üstten 1-2 mm genişletmek kimliği ilgili mikro-sürücü.
- Tutkal5 dakikalık epoksi veya siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak mikro-sürücü desteği tüp taşıyıcı tüp. Not tutkal ya da çok ince epoksi destek kanül akışı ve mikro sürücü serbest hareket veya kötü engel olacağı için, kılavuz kanül düzeltin. Bu durumda, söz konusu mikro-tahrik ünitesi kullanılamaz.
- Tamamen tüm mikro-sürücüler daha düşüktür. Taze bir jilet kullanarak kolektör kanül altındaki gömme kapalı tüm taşıyıcı tüpler kesin.
- Son olarak, iki vidayı (1-72, uzunluk: 3 / 16 "boyutunda) kullanarak sürücü tabanına Neuralynx elektrot arayüz kartı monte edin.
Bu noktada sürücü dizi tetrodes yüklü hazırdır. Mikro diskler içine nasıl yükleneceği tetrodes imalatı, ve nasıl cerrahi implantasyon için sürücü dizi hazırlamak için, bir sonraki video makalenin konular.
Şekil 1 bitmiş mikro-drive dizisi Modeli. Bir mikro-drive bir dizi, birkaç önemli bileşenlerinden oluşmaktadır: tetrodes beyin girdiği bir koleksiyoncu kanül; plastik bir sürücü tabanı 21 mikro diskler, her sürücünün tek bir tetrode ön amplifikatörlere bağlayan bir elektrot arayüz kartı.
Şekil 2 Özel mikro sürücü vidalar özel bir vida dizaynı A. Teknik çizimler . Vida dişli bir parçası (M1.2x0.25; 1.2 mm çap, 0.25 mm / dönüş) özellikleri, özel yapılmış tornavida ve dudak ile pürüzsüz bir kısmı (detay) eşleşen bir yarım silindir kafası B. Modeli tam bir mikro-sürücü. Destek tüpü ve özel vida diş çimento ile bağlanmıştır. Vida dudak, diş çimento gömülü ve destek tüpü yukarı veya aşağı sürüş sırasında ücretsiz döndürme için izin verir.
Ek Dosyalar
Baskılı sürücü temel, koruyucu koni ve SolidWorks 2008 3D CAD yazılımı mikro sürücüler kalıp yapımı için tasarlanmıştır:
- : DriveBase.sldprt sürücü taban ve koruyucu koni ve kapak modelleri içeren dosyayı indirin .
- Dosyayı indirin: MicroDriveMold.sldprt mikro-sürücü kalıp modeli içeren
3D baskı hizmet bürosu doğrudan yerli Solidworks dosyaları işlemek değil, stereolitografi CAD biçimi (KVS) tasarım dosyaları gerektirir olamaz. Solidworks yazılımı erişim zorunda değilsiniz, ama yine de video makalede kullanılan basılı parçalar kullanmak istiyorum insanlar için biz de STL formatında tasarımları şunlardır:
- : DriveBase.stl sürücü tabanı modeli içeren dosyayı indirin
- : MicroDriveMold.stl mikro sürücü kalıp modeli içeren dosyayı indirin
- : ProtectionCap.stl koruyucu koni için kapak modeli içeren dosyayı indirin
- : ProtectionCone.stl koruyucu koni modeli içeren dosyayı indirin
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, mikro-sürücü inşa sürecinin genel özelliklerini açıklar. Bu başarıyla, birden fazla kayıt hedefleri veya kayıtları için farelerde küçük dizileri ile sürücü dizileri üretmek için modifiye edilmiştir. Hipokampus kaydına ek olarak, birçok araştırmacı bu sürücüler kortikal ve sub-kortikal yapıları hedef kullanın. Uzun vida kullanımı, derin beyin yapıları kayıt için gerekli olabilir. Sürücü tabanı için kapsamlı bir değişiklik ile, motorlu, daha hassas, uzaktan tetrode ayarı (Yamamoto ve Wilson, 2008) sağlayan, elle açık olanları yerine kullanılan sürücüler. Özelleştirilmiş sabit kılavuz kanül düzenlemeler korteks ve hipokampus tetrodes dağılımı üzerinde mekansal kontrolü sağlamak için dairesel ana kanül yerde kullanılmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Biz laboratuarımızda bilgisayar tasarlanmış, 3-D baskılı sürücüler farelerde kayıt için kullanımı kaynaklı Linus D. Sun ve Jeenah Jung kabul etmek istiyorum. Buna ek olarak, mikro-sürücü ve laboratuarda tetrode teknoloji geliştirme katkılarından dolayı tüm geçmiş ve mevcut Wilson Lab üyeleri kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3D-printed plastic parts | Material | American Precision Prototyping (www.approto.com) | |
| stainless steel tubing | Material | Small Parts (www.smallparts.com) | |
| Dental cement powder | Material | A-M Systems (www.a-msystems.com) | 525000 |
| Dental cement solvent | Material | A-M Systems | 526000 |
| Electrode interface board | Material | Neuralynx (www.neuralynx.com) | EIB-81 |
| micro-drive screws | Material | Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com) | |
| ’Tap-Ease’ tapping lubricant | Tool | AGS Company | TA-2 |
| Polyimide tubing | Material | IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com) | |
| Cordless drill/driver | Tool | DeWalt (www.dewalt.com) | DC750KA |
| Variable-Speed Rotary Tool Kit with Flex-Shaft | Tool | Dremel (www.dremel.com) | 3956-02 |
| Razor blades | Tool | VWR (www.vwr.com) | 55411-050 |
| Watch glass | Tool | VWR | 66112-107 |
| Tap for custom screws | Tool | Balax | 01302 |
| Taps | Tool | Small Parts | HSBT-0172, HSBT-0080 |
| Pin vise | Tool | Vargus | 3SHC1--I |
| Drill bits | Tool | Small Parts | |
| Benchtop vise | Tool | Panavise | 301 |
| No.2 Dumont forceps | Tool | Stoelting (www.stoeltingco.com) | 52100-27 |
| 5-minute epoxy | Tool | Allied Electronics (www.alliedelec.com) | |
| Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers | Tool | Aven (www.aveninc.com) | 18768 (Pattern 304) |
| Micro Dissecting Scissors | Tool | Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com) | 25-1000 |
| Xcelite 378M Pliers | Tool | Newark | 96F8903 |
| mini pin vise | Tool | MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com) | 00920314 |
References
- Yamamoto, J., Wilson, M. A. Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals. J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).
