慢性のためのマイクロドライブアレイ in vivoで録音：四極管アセンブリ

Summary

このプロトコルでは、ラットの慢性的な電気生理学的記録のために設計されたマイクロドライブアレイで使用するためのtetrodesを作製し、条件する方法を示しています。さらに、我々は、インストールのアース線と保護円錐を含むマイクロドライブアレイの建設、最終段階を示しています。

Abstract

テトロード、4つの電極の束は、生体内で複数のニューロンの同時記録のための貴重なツールであることが実証されています。テトロードのチャネルを介した活動電位署名の差動振幅は、マルチユニットの信号から単一ユニットの活性を分離することができます。正確に四極管の定位位置と深さを制御する能力は、脳の領域全体で整合性のとれた神経活動を研究するために重要です。マイクロドライブアレイと組み合わせることで、それは数日から数週間の経過を正確に配置し、多くのtetrodesの安定した制御を達成することが可能である。このプロトコルでは、我々は、ラットにおける慢性的なin vivoでの録音のためのマルチドライブテトロード配列にtetrodesをインストール、基本的なツールや材料を使用してtetrodesを作製し、条件にする方法、マイクロドライブのアレイへのアース線の接続を確立し実証する、と環境との物理的な接触からtetrodesを保護するために、マイクロドライブのアレイ上に保護用のコーンを取り付けます。

Protocol

1。 tetrodesの作製

1. 長さ50センチメートルを取得して、1つ四極管の建設を開始、12.5ミクロンの直径のコアと絶縁、NI -クロム線をポリイミド。半分に線を折る。それらがくっつきようにペアに沿って指を実行します。ワイヤのペアがその全長にわたって良好な接触を持っていることを確認してください。
2. 一緒に両端を保持することによって再びペアを折る。一端に形成されるループがねじれていないことを確認してください。 4つのヒントが合うように非ループの端の4本の線をカット。
3. 次のステップでは、修正されたワニ口クリップ、電動回転装置、旋回装置上の水平バーが必要になります。ワニ口クリップを接着することにより、クリップのベースにプラスチック製のバーが変更されます。ワイヤの先端が露出している場合には、修正されたワニ口クリップと一緒に4本の線をクランプする。水平バーの上にワイヤーのループをハングアップする。電動ステージにワニ口クリップを置きます。
4. 約3分かけてワイヤの束〜40カウンタークロックワイズねじれが続く80クロック単位でひねりを適用します。これらのパラメータは、必要に応じて変化させることができる。
5. テトロードのねじれが完了すると、中低フローを使用して、ヒートガン（420 ° Cまたは790 ° F）で3つの異なる形から加熱して一緒にワイヤーを融合する。それぞれの角度の場合、約5秒間の配線から2cmの距離で、電線束が分割下記1〜2センチメートルを始めるヒートガンを駆け降りるとまで。高温で完全に断熱材を溶融し、短絡につながるとして、十分に注意してください。
6. 今すぐワイヤが一緒に融合していることを、そっと四極管の緊張を緩和するために、ワニ口クリップを持ち上げて、ねじれ装置からテトロードを削除し、ワニ口クリップの近くに四極管をカット。もう一方の端で、同じ長さのワイヤの4つの非結合ストランドが存在するようなループをカット。
7. 次に、柔らかい先端がピンセットで線を曲げることにより上部の個々のストランドを分離する。
8. テトロードは現在のマイクロドライブの配列にロードするための準備ができています。 21から25以上のtetrodesを作成し、それがテトロードのロードプロセスのための時間になるまで、埃のないボックスに格納します。

2。マイクロドライブアレイにtetrodesとアース線をロード

1. 続行するには、完全なマイクロドライブアレイが必要になります。あなたがまだ一つを構築していない場合、ビデオを参照してください"慢性的なin vivoでの録音のためのマイクロドライブアレイ：。ドライブの製造"私たちの設計計画では、四極管は、コネクタハードウェアの一端に装着され、電極チップは、マイクロドライブアレイのベースの下に延びるように、マイクロドライブにポリイミドキャリアの管を通って実行されます。
2. 開始する前に、一端にコネクタボードに取り付けることができる、そしてもう一方の端に、panaviseによってクランプすることができるドライブのホルダーを構築する。この例では、ドライブのホルダーは、X - ACTOのナイフのハンドル（図1c）の一方の端に接着ミル- maxのコネクタです。
3. マイクロドライブのいずれかのキャリアのチューブをポリイミドに柔らかい先端がピンセットで四極管を保持し、ステレオスコープを用いて、四極管の先端を押してください。個々の電極ワイヤは、ドライブアレイの最上部にあるコネクタボードに近いようになるまでチューブに四極管を押し込みます。キンクたり、曲げたり電線を、それが四極管の角度で、脳ではなく、垂直に入るの原因となります、と四極管の整合性を弱体化するように注意してください。
4. 柔らかい先端がピンセットを用いて電極のインタフェースボードのそれぞれの穴に4本のワイヤーのもう一方の端をフィード。もう一度、配線をよじれたり、曲げないように。場所内のすべての4本のワイヤで、短縮下顎を持っているプラ​​イヤーでその穴に金色のピンを押してください。ピンが穴に押し込まれている場合、彼らは、銅線の絶縁被覆と電気的に接続を作成します。
5. 後で参照するために、マイクロドライブ、電極インタフェースボード上のピン位置との間のマッピングを追跡します。
6. 18 tetrodesの合計のロードを続行。アレイ上の残りの3つのマイクロドライブは、参照電極を収容するために使用されます。各参照電極は、4つのアンボンドワイヤの端の一方のみを使用する四極管で作られています。参照電極を取り付けるために、ローディングの手順に従いますが、コネクタの基板上のそれぞれの参照電極のピンに4つの電極の一方のみを添付する。
7. あなたがマルチサイト録音を計画している場合、それはtetrodesから事前にコネクタボードへの接続を計画する価値があるかもしれない。これは、実験中に間違って四極管の調整の可能性を最小限にする必要があります。
8. テトロードのローディングが完了すると、2つの接地線、動物用と保護コーンのための1つを行います。 1つの6"長い絶縁鋼線（テキスト：0.005"直径）をカットし、ワイヤの両端から、金属製のピンセットを使用して、絶縁体の周囲3mmを削除します。次に4をカット"長い間絶縁鋼線（テキスト：0.005"直径）。一端と反対側で1 cmの絶縁体の周囲3mmを削除します。
9. インタフェースボードに向かってマイクロドライブアレイと、最大の側面の穴に通します6'アース線を。指定された地面の穴でゴールドピンと電極界面のボードへの導線が接続してください。この線は、動物の頭蓋骨に接続します。
10. 以前にインストールされているアース線への経路4'アース線に平行。別の指定された地面の穴に金のピンを使用して電極のインタフェースボードから3mm被覆をはぎとった端を接続します。この線は、後でノイズのピックアップを減らすために小さなファラデーケージとして機能する保護コーン、に接続されます。我々は現在、接続ワイヤを終了していると私たちのtetrodesを精製に進むことができます。

3。 tetrodesの長さを設定する

1. この過程で私たちの目標は、彼らが少し長くターゲットの脳の構造の深さよりもされるように、すべてのtetrodesをカットすることです。この例では、マイクロドライブは、多くの新皮質の領域と成体ラットの背側海馬に到達するのに十分な5〜6ミリメートル、最大旅行のために設計されています。最初に、tetrodesが最大限に露出するようにすべてのマイクロドライブを下げる。同時に鋭い細かいハサミを用いて所望の最終的な長さより約5mm長い長さにすべてのtetrodesをカット。
2. 最後のカット​​の場合は、panaviseで鋸歯はさみのペアを用意。わずかな角度の下方で、ダングリング他のハンドルを残したまま、上向きセレーション付つのハンドルをクランプする。
3. 今すぐ完全にマイクロドライブを上向きにすることで、彼らのガイドカニューレにすべてtetrodesを撤回。
4. ステレオスコープを使用して、完全にそのカニューレから一テトロードを引き出さない。ガイドカニューレから所望の距離で定規、位置ギザギザハサミを使用する。ゆっくりとゆっくりとの滑らかな動きとの四極管をカット。この四極管が切断された後、3〜4ミリメートルで、最大のマイクロドライブ撤回。すべてが切断されるまで、各テトロードに、このプロセスを繰り返します。この時点で、金めっきのための準備が整いました。

4。 tetrodesと品質チェックの金めっき

ニクロムテトロード線をメッキゴールドは、長期安定的な録音のための非常に重要です。それは腐食し、改善する生体適合性を防ぎます。

1. 外部モードでのインピーダンスメータとオーディオ出力（図1d）とDCのチェックモードでの電流発生器をセットアップします。各四極管内のチャネルの6つのペアに現在の発電機の2本のリード線をタッチし、ショートパンツがペア間に存在するかどうかを判断するために、オーディオフィードバックを使用してください。短絡が存在する場合は、もう一度鋸歯状のはさみとテストと四極管を再カット。問題が解決しない場合は、四極管を破棄し、それを交換してください。
2. ショートパンツはすべてtetrodes内に存在しない場合、のような遠いできるだけすべてtetrodesを拡張し、すべてのマイクロドライブを下に移動。
3. 電極のインピーダンス（図1e）チェックするための機器構成を変更します。今すぐすべてのtetrodesのヒントは、標準の金めっき液の浴に手をつける。金浴を電気的インピーダンスの電圧計の正側に接続されている。コネクタボード上の対応する端子にインピーダンスメーターの負のリード線に触れることにより、電極のインピーダンスを確認してください。
4. マイクロドライブのアレイ上のすべてのワイヤのインピーダンスを測定し記録する。正常値は1-3 Mohmをからの範囲。
5. 現在の発電機では、1〜3μAの間に電流を設定します。次に、しっかりとコネクタ基板上の端子にインピーダンスメーターの負のリード線を取り付けます。電気めっきの構成（図1F）に機器を置きます。インピーダンスメータでは、すぐにバックモードをバイパスするために、通常モードから切り替えて、と。バイパスモードでは、現在では、四極管と金溶液を通過する、とゴールドは、電極の先端上にプレーティングされます。メッキの各ラウンド後のインピーダンスは、以前よりも小さくする必要があります。インピーダンスは1MΩを上回るの下にドロップしなかった場合の電流パルスを繰り返します。許容インピーダンスの保守的な範囲は350キロオームに250kOhmです。インピーダンスが200キロオームを下回った場合、これは短絡している可能性があります。
6. 繰り返しパルスの後のインピーダンスが十分に低下しない場合、電極の先端が詰まっされることがあります。テトロードを再カット、ショートパンツをチェックし、金メッキ処理を繰り返します。再加工で効果がない場合は、四極管を交換し、再度起動してください。
7. すべてtetrodesをメッキした後、エタノールで簡単にテトロードのヒントを浸し、そして、それらが3〜5分間乾燥させます。
8. 空気にさらさテトロードのヒントを、現在のジェネレータを使用してtetrodes内で短絡回路のテスト。 DC接続は、四極管の二つ以上の電極の間に存在する場合は、再び金で四極管、そしてプレートを再カット。
9. すべてtetrodesの金メッキが完了したら、各tetrod間のインタフェースに中厚シアノアクリレート接着剤のドロップを追加eとそのはチューブポリイミド。これは、マイクロドライブに四極管を固定し、四極管の長さを維持します。
10. 最後のステップとして、すべてのネジを回して、ドライブにすべてのtetrodesを移動する。

5。保護コーンの取り付け

保護コーンの目的は、環境からのマイクロドライブと露出テトロードのワイヤーを保護することです。また、実験中に処理するためのサポートを提供し、電気的なノイズを低減します。我々は3次元印刷プラスチックコーン（：ドライブの製造リファレンスパートI）を使用してください。しかし、それは缶ソーダの曲がった部分のように、他の材料から円錐を作ることは可能です。

1. プラスチック製のコーンに乗り、内側または外側の表面にいくつかのアルミ箔テープを修正。
2. 次に、コーンを通して小さな穴（直径1.5 mm）をドリルダウンして、ゆるく円錐内部にワッシャーとナットでネジを取り付けます。これは、アース線の電気の通路として機能します。我々は00から80サイズのネジとワッシャーの組み合わせを使用することをお勧めします。
3. 最初に、挿入と部分的に円錐の側面に3つ1〜72サイズのネジを（長さの3 / 16インチ）にします。ドライブアレイは一時停止して、ドライブ上のコーンを挿入します。両方のアース線は、ドライブアレイの底から伸びることを確認してください。何回か1から72のネジを1本の周りに4'アース線の露出部分をラップし、しっかりとネジを締めます。残りの二つの円錐のネジを締めて、ドライブのベースにコーンを固定します。
4. 最後に、1cmの短いアース線の被覆のない部分を取ると箔テープと座金との間で、ネジの周りにそれを巻き。ネジを締めて、地面を固定します。今、私たちは最後に外科的移植の準備ができているマイクロドライブアレイを持っている。

6。代表的な結果

1. マイクロドライブアレイの生産はこれで完了です。あなたのマイクロドライブアレイは、18 tetrodesと3つの参照チャネルがロードされます。それは耐久性の保護コーンとキャップに収められています。保護コーンと終了のマイクロドライブアレイは、平均で25gまで20グラム重量を量る。
2. 終了ドライブアレイは、標準的な外科的処置を用いて注入される。ご覧のように、ドライブはプリアンプのチップとデータ集録ハードウェアとソフトウェアに信号を伝送する線の束に取り付けられています。

図1：テトロードねじれ設定の）回路図。水平バーは自動化されたテトロード式ツイスト装置上記の四極管の未結合電極ワイヤを中断。テトロードのインピーダンスの測定と電極メッキ用B）のセットアップ。短絡をチェックするときに、回路が異なっている：。黒いワイヤがコネクタの基板上の別の電極のチャネルに接続されているC）クローズアップカスタムのマイクロドライブアレイホルダーのツールが作ら。円筒形のバーは、X - Actoのナイフの柄です。コネクタは26ピン、二列、ミル- maxのコネクタです。短いチェックのための2つの部分が歯のアクリルを使用して互いに結合している。D）の構成。チャンネルXとチャンネルYは4テトロードチャネルの任意の2つの異なったチャネルである。E）電極インピーダンスを測定するための構成。電流源は、'off'です。インピーダンスメーターが'on'と'試験'に設定されています。F）は、電極チップの金めっきの構成は、。電流源が'on'の場合、オーディオが'on'であるために設定され、モードは"ユニポーラ"であり、DCテストが'on'である、現在は2マイクロアンペアに設定されています。

Discussion

このプロトコルは、2つの部分のプロトコルの第2回目です："​​in vivoで録音慢性用マイクロドライブアレイ。"マイクロドライブアレイと四極管の組み合わせが目を覚ましに多くのニューロンの同時録画を取得するための強力なツールである、動物の準備を振る舞っ。うまくいけば、我々はあなたがあなた自身の研究室で電気生理学的記録を開始または改善するために必要となるために必要なすべての情報を提供している。

電動テトロードツイスターのデバイスは、カスタム設計と作製した。我々はあなたが同様の機能を持つデバイスを注文できるようになりますベンダーと部品番号を提供している。また、電動旋回装置は、単にワニ口クリップに接続されている磁化攪拌棒を電動回転棒磁石を組み合わせることにより、社内で構築することができ、この構成は、ほとんどの回転、回転方向の手動反転のカウントマニュアルが必要になります、と開始/停止マニュアル。

いくつかの電極のインタフェースボードは、電極のワイヤを接続するためのピンとホールのメカニズムを持っていない。代わりに、コネクタボードから拡張金属ピンを持っているインタフェースボードを取得した可能性があります。このような金属製のピンは、多くの場合、標準的な電子部品に見られるものと類似しています。我々は、簡単に金属ピンにテトロードチャネルを接続するための方法論を概説しています。最初に、各四極管の4つの電極ワイヤの先端に絶縁体を取り除く。これは、ハンドヘルドブタンのトーチを使用して、できるだけ簡潔に、各電極の先端に炎を適用することによって達成されます。金属製のピンを介して簡単にフィットするシュリンク取得し、シュリンクラップが加熱された後にしっかりとピンを絞る予定。金属のピンの長さにシュリンクラップチューブをカット。銀の塗料でシュリンクラップを埋めるために毛細管現象を使います。シュリンクラップに1つの電極のワイヤの露出先端を挿入します。ゆっくりと電極ワイヤは、ピンとシュリンクラップの壁との間になるように金属製のピンを介して収縮ラップをスライドさせます。テトロードの残りの3つの電極のチャネルに対して、これらの手順を繰り返します。最後に、ヒートガンの横方向の動きと、（シュリンクラップ内部電極ワイヤ付き）シュリンクラップで覆われた4本のピンを加熱する。この時点で、テトロードとコネクタボード間の安定性と信頼性の高い接続が必要です。

ほとんど力がそれらを傷つけないように必要とされるこれらの製造全体の手順は慎重に電極ワイヤを扱う。そこに四極管とマイクロドライブアレイの手順の多くのステップがあり、各ステップでは、高品質なデータを得るために他の人と同じくらい重要です。ここで説明するプロトコルは、私たちの研究室が利用できる機器を考慮するためによく働いています。あなた自身の研究室でリソースが異なる場合があります、したがって、慎重に各ステップを検討し、最適なパフォーマンスを達成するために、独自の要件と制約を満たすためにプロトコルを変更することを躊躇しない。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.