Микро-диск массива при хроническом В естественных условиях Запись: Тетроде Ассамблеи

Summary

В этом протоколе мы показали, как изготовить и состояние тетроды для использования с микро-диск массива, который был разработан для хронических электрофизиологических записей у крыс. Кроме того, мы проиллюстрируем на заключительной стадии микро-дисков массива строительства, которая включает в себя установку заземления и защитного конуса.

Abstract

Тетрод, пучок из четырех электродов, оказалась ценным инструментом для одновременной записи нескольких нейронов в естественных условиях. Дифференциальных амплитуда потенциала действия подписей за каналы тетрод позволяет изоляции единичного деятельности от многоквартирных сигналов. Возможность точно контролировать расположение стереотаксической и глубину тетрод имеет решающее значение для изучения скоординированных нейронной активности мозга по регионам. В сочетании с микро-дисков массива, то можно добиться точного размещения и стабильный контроль над многими тетроды в течение дней или недель. В этом протоколе, мы показали, как изготовить и состояние тетроды с использованием основных средств и материалов, установить тетроды в многодисковых массивов тетрод при хронических в естественных условиях записи в крысу, соединение провод заземления к микро-диск массива, а прикрепить защитный конус на массив микро-диска, чтобы защитить тетроды от физического контакта с окружающей средой.

Protocol

1. Изготовление тетроды

1. Начало строительства одного тетрод, получив 50 см длиной, полиимида изолированы, ни-хром проволоки с диаметром сердцевины 12,5 мкм. Согните пополам. Выполнить пальцами по паре, чтобы заставить их держаться вместе. Убедитесь, что пара проводов имеют хороший контакт на протяжении всей своей длине.
2. Сложите пару раз, держа два конца вместе. Убедитесь, что петли, образованной на одном конце не изломами. Вырезать четыре провода на не-петельные конца так, чтобы четыре подсказки выровнены.
3. Для следующего шага, вам необходимо изменение крокодил, моторизованные поворотным устройством, и турник выше поворотным устройством. Крокодил модифицируется склеиванием пластиковых бар к основанию клипа. Где проволоки советы подвергаются, зажим четыре провода вместе с модифицированным крокодил. Повесьте петля провода на турнике. Место крокодил в моторизованных этапе.
4. Применяют 80 по часовой стрелке повороты следуют 40 против часовой стрелки поворотов к проводу расслоение над течение примерно трех минут. Эти параметры могут быть изменены в соответствии с вашими потребностями.
5. После тетрод крутящий завершен, предохранитель провода вместе при нагревании из трех различных углов с тепловой пушки (420 ° С или 790 ° F), с использованием средне-низкий поток. Для каждого угла, начинают на 1-2 см ниже, где провод пучок расщепляется, запустить тепловая пушка вниз и вверх на 2 см, расстояние от проводов в течение 5 секунд. Будьте осторожны и при высоких температурах полностью расплавиться изоляция и привести к короткому замыканию.
6. Теперь, что провода соединяются вместе, удалите тетрод от скручивания аппарата осторожно приподнимая крокодил для снятия напряжения на тетрод, и сократить тетрод возле крокодил. На другом конце, сократить цикл так, что Есть четыре несвязанных нитей проволоки одинаковой длины.
7. Далее, отдельные отдельные пряди в верхней, аккуратно изгиб провода с мягким наконечником пинцет.
8. Тетрод готов к загрузке в микро-дисков массива. Сделайте 21 до 25 более тетроды и хранить их в пыли окна, пока не будет времени для процесса загрузки тетрод.

2. Загрузка тетроды и наземных проводов в микро-дисков массива

1. Чтобы продолжить, вам необходимо полное микро-дисков массива. Если вы еще не построили один, см. видео «Микро-дисков массива при хронических в естественных условиях записи. Привод изготовления" В нашей дизайн-план, тетрод будет прикреплен одним концом к разъему оборудования, и продлится до полиимида перевозчиком труб в микро-привод, что электрод советы продлить ниже основания микро-диск массива.
2. Прежде чем начать, построить диск держатель, который может быть подключен к разъему платы на одном конце, а на другом конце, может быть прикреплена к Panavise. В этом примере диск держатель Mill-Max разъем приклеены к одному концу X-ACTO рукоять ножа (рис. 1в).
3. Холдинг тетрод с мягким наконечником пинцетом и с помощью стереоскоп, нажмите кончиком тетрод в полиимида перевозчика трубку одного из микро-диски. Нажмите тетрод в трубку, пока отдельные провода электрода близко к разъему платы в верхней части диска массива. Будьте осторожны, чтобы не излом или изгиб провода, так как это приведет к тому, тетрод, чтобы войти в мозг под углом, а не перпендикулярно, а также ослабит целостность тетрод.
4. Аккуратно кормить другой конец четыре провода в соответствующие отверстия в плате электрода интерфейс, используя мягкую наконечником пинцетом. Опять же, во избежание перегибов или изгиб провода. Со всеми четырьмя проводами на месте, нажмите золотые булавки в свои норы с плоскогубцами, которые сократили нижней челюсти. Когда штифты толкнул в отверстие, они обнажат изоляции проводов и создают электрическое соединение.
5. Для дальнейшего использования, отслеживать соответствие между микро-диски и пин-код позиция на доске интерфейс электрода.
6. Продолжить загрузку общей сложности 18 тетроды. Остальные три микро-диски на массив будет использоваться для размещения электродов. Каждый электрод изготовлен из тетрод, который использует только один из четырех несвязанные концы проволоки. Для присоединения электродов сравнения, Соблюдены процедуры, но приложить только один из четырех электродов для соответствующих контактных электрода сравнения на разъеме платы.
7. Если вы планируете на нескольких площадках записи, возможно, есть смысл планировать соединения от тетроды к разъему платы заранее. Это должно свести к минимуму возможность корректировки неправильно тетрод в процессе экспериментов.
8. После тетрод загрузка завершена, сделать два провода заземления, по одному для животных и один для защитного конуса. Отрежьте один 6 'длинный изолированный стальной проволоки (текст: 0,005 "диаметра) и снимите 3 мм изоляции, используя металлический пинцет, с каждого конца провода. Затем вырежьте 4«Длинных изолированных стальной проволоки (текст: 0,005" диаметра). Удалить 3 мм изоляции на одном конце и 1 см на другом конце.
9. Маршрут провод заземления 6 'через отверстие на боковой микро-дисков массива и вверх, к интерфейсной плате. Подключите оголенный провод к плате интерфейса электрод с золотой нагрудный знак в назначенное земле дыру. Этот провод соединяется с черепом животного.
10. Маршрут 4 'заземляющий провод параллельно ранее установленного заземления. Подключение 3 мм лишил конец электрода борту интерфейс с использованием золотой нагрудный знак в другой назначенный земле дыру. Этот провод в дальнейшем будут подключены к защитным конусом, который будет действовать как маленькую клетку Фарадея, чтобы уменьшить шум пикап. В настоящее время мы закончили соединительных проводов и может приступить к переработке нашей тетроды.

3. Настройка длины тетроды

1. Наша цель в этом процессе, чтобы отключить все тетроды, чтобы они были немного длиннее, чем глубина структуры мозга цели. В нашем примере, микро-диски рассчитаны на максимальный ход 5-6 мм, достаточной для достижения многих областях неокортекса и спинной гиппокампе взрослых крыс. Во-первых, ниже всех микро-дисков, чтобы тетроды максимально подвержены. Одновременно сократить все тетроды к длинам, которые приблизительно на 5 мм длиннее желаемой конечной длины с помощью пары резких тонких ножниц.
2. Для окончательного монтажа, подготовки пары зубчатых ножниц в Panavise. Зажим одной ручкой с небольшим углом вниз и с зубцами вверх, оставляя другие ручки болтались.
3. Теперь полностью вывести все тетроды в их руководстве канюли поворотом микро-диски объемом.
4. Использование стереоскоп, полностью расширять один тетрод из его канюли. С помощью линейки, должность зубчатыми ножницами на нужном расстоянии от руководства канюли. Медленно и аккуратно вырезать тетрод с одним плавным движением. После этого тетрод была сокращена, снять микро-привод на 3-4мм. Повторите эту процедуру для каждого тетрод, пока все были сокращены. На этом этапе вы готовы к золотым напылением.

4. Золотое покрытие из тетроды и контроль качества

Золотое покрытие нихромовой провода тетрод имеет решающее значение для долгосрочного стабильного записей. Он предотвращает коррозию и улучшает биосовместимость.

1. Установка измерителя импеданса в режиме внешнего и генератор тока в постоянный ток контрольно-пропускного режима с аудио выходом (рис. 1г). Сенсорный два провода от генератора тока для шести возможных пар каналов в каждом тетрод, и использование акустической обратной связи, чтобы определить, шорты существуют между парами. Если коротко существует, повторно сократить тетрод зубчатыми ножницами и тест снова. Если проблема не устраняется, удалите тетрод и замените его.
2. При отсутствии шорты существуют во всех тетроды, переместите все микро-дисков вниз, продолжив все тетроды так далеко, насколько это возможно.
3. Изменить конфигурацию оборудования для проверки сопротивления электрода (рис. 1д). Теперь опустите кончики всех тетроды в ванну стандартных позолотой решение. Золотой ванне электрически соединен с положительный вывод сопротивление метр. Проверьте сопротивление электрода, касаясь отрицательный провод от измерителя импеданса в соответствующие контактный разъем на плате.
4. Измерьте и запишите сопротивление каждого провода на микро-дисков массива. Нормальный диапазон значений от 1-3 МОм.
5. На генератор тока, установите ток между 1-3 мкА. Затем надежно закрепить отрицательный провод от измерителя импеданса на контактный разъем на плате. Место оборудования в гальванических конфигурации (рис. 1е). На сопротивление метр, быстро переключаться из нормального режима, режима в режим байпаса, и обратно. Находясь в режиме обхода, ток будет проходить через тетрод и золота решения, и золото будет высевали на конец электрода. Сопротивление после каждого раунда покрытие должно быть меньше, чем раньше. Повторите импульса тока, если сопротивление не опускалась ниже 1 МОм. Консервативный диапазон допустимых сопротивлений являются 250kOhm до 350 кОм. Если сопротивление падает ниже 200 кОм, это может указывать на короткое замыкание.
6. Если после повторных импульсов сопротивление не падает достаточно, конец электрода может быть ограничен. Re вырезом тетрод, проверьте шорты, и повторить позолотой процесса. Если повторно резка не помогает, замените тетрод и начать все заново.
7. После покрытия всех тетроды, окуните тетрод советы кратко в этаноле, и дайте им высохнуть в течение 3 до 5 минут.
8. Тест на короткое замыкание в тетроды использованием генератора тока с тетрод советы контакте с воздухом. Если соединение постоянного тока между двумя или более электродами тетрод, а также подрезайте тетрод, и тарелку с золотом снова.
9. После золочение всех тетроды завершена, добавить каплю средней толщины циано-акрилата клей интерфейс между tetrodэлектронной и его полиимида труб. Это обеспечит тетрод его микро-привод и поддерживать длину тетрод.
10. В качестве последнего шага, переместить все тетроды в дисковод, поворачивая все винты вверх.

5. Крепление защитного конуса

Целью защитного конуса является защита микро-диски и подвергается тетрод провод от окружающей среды. Она также обеспечивает поддержку для обработки во время эксперимента и уменьшает электрические помехи. Мы используем 3-D печатных пластиковые конуса (Ссылка Часть I: диск изготовления). Однако, это можно сделать конус из других материалов, например изогнутые части соды может.

1. Возьмите пластиковый конус и исправить некоторые ленты алюминиевой фольги на внутренней или наружной поверхности.
2. Далее, просверлить маленькое отверстие (1,5 мм в диаметре) с помощью конуса и свободно закрепить винт с шайбой и гайкой внутри конуса. Это будет служить электрической проход для заземления. Мы рекомендуем использовать 0-80 винт и шайбу размера комбинации.
3. Во-первых, вставки и частично свою очередь, три 1-72 размер винта (3 / 16 дюймов в длину) в стороны конуса. С диска массив приостановлено, вставьте конус над приводом. Убедитесь, что оба провода заземления простираются от нижней части диска массива. Оберните обнаженной части провода заземления 4 'вокруг одного из 1-72 винты в несколько раз и закрепите винтом плотно. Закрепите конус на диск базу путем ужесточения оставшиеся два винта конус.
4. Наконец, возьмите 1 см лишил конце короткий провод землей и ветром его вокруг винта, между лентой фольги и шайбы. Безопасные землю, затянув винт. Теперь у нас есть микро-диск массива, который, наконец, готов к хирургической имплантации.

6. Представитель результаты

1. Микро-диск массива производство завершено. Ваша микро-дисков массива загружается с 18 тетроды и 3 канала ссылки. Он заключен в защитный конус и шапку на прочность. Закончил микро-дисков массива с защитным конусом весит 20 г до 25 г в среднем.
2. Готовых дисков массива имплантируется использованием стандартной хирургической процедуры. Как видите, диск крепится к чип предусилителя и пучок проводов, несущих сигнал данным на приобретение оборудования и программного обеспечения.

Рисунок 1:) Схема конфигурации крутящий тетрод. Турник приостанавливает несвязанные провода электрода тетрод выше автоматизированные устройства крутящий тетрод. Б) установки для измерения импеданса тетрода и электродов покрытий. При проверке на коротких замыканий, схема иная:. Черный провод, подключенный к другому электроду канал на плате разъем C) крупным планом на заказ микро-дисков массива держатель инструмента. Цилиндрический стержень является X-Acto рукоять ножа. Разъем 26-контактный, двухрядные, Милл-макс разъем. Две части связаны вместе с помощью стоматологического акрила. D) Конфигурация для короткой проверки. Канал и Канал X Y какие-либо два разных канала из четырех каналов тетрод. E) Конфигурация для измерительного электрода импеданса. Источник тока "выключено". Сопротивление метра установлен в 'на' и 'испытание'. F) Конфигурация для золотого покрытия электродов советы. Источник тока находится в положении 'на', звук "о", режим 'однополярный', DC тест "на", ток равен 2 мкА.

Discussion

Этот протокол второй части две части протокола: "Микро-дисков массива при хронических в естественных условиях записи." Сочетание микро-дисков массива и тетрод является мощным инструментом для получения одновременных записей многих нейронов в бодрствует, поведение животных подготовки. Будем надеяться, что мы предоставили вам всю необходимую информацию для Вас понадобятся, чтобы начать или улучшить электрофизиологические записи в вашей собственной лаборатории.

Моторизованные тетрод твистер устройства была специально спроектированы и изготовлены. Мы предоставили производителя и номер детали, которая позволит вам заказать устройство с подобной функциональностью. Кроме того, моторизованный поворотное устройство может быть построена в доме просто, комбинируя бар моторизованный вращающийся магнит с намагниченной мешалкой, который прилагается к крокодил; этой конфигурации, скорее всего, требуют ручного подсчета оборотов, автоматический разворот направления вращения, и ручного запуска / остановки.

Некоторые платы электрод не имеют контактный и отверстие для подключения механизмов электродной проволоки. Вместо этого, вы можете получить интерфейсной платы, которая металлические штифты, которые выходят из разъема платы; таких контактов металл аналогичны тем, которые часто встречаются на стандартных электронных компонентов. Мы кратко методологию для подключения тетрод каналы металлические штифты. Во-первых, удалите изоляцию на кончиках четырех электродных проволок каждого тетрод. Это достигается за счет применения пламени до кончика каждого электрода как можно короче использованием портативных факел бутана. Получить термоусадочная пленка, которая будет соответствовать легко через металлический штырь, и прижмет контактный плотно после того, термоусадочная пленка была нагрета. Вырезать термоусадочных трубок обернуть к длине металлический штырь. Использование капиллярного действия, чтобы заполнить термоусадочная пленка с серебряной краской. Вставьте подвергаются кончик одного электрода провод в термоусадочную пленку. Аккуратно вставьте термоусадочная пленка на металлический штырь, что электродной проволоки между контактный и стены термоусадочная пленка. Повторите эти действия для остальных трех электродов каналов тетрод. Наконец, из стороны в сторону движения тепловой пушки, тепловые четыре контакта покрыта термоусадочная пленка (с электродов провода внутри термоусадочная пленка). На данный момент, вы должны иметь стабильную и надежную связь между тетрод и разъем платы.

На протяжении всех этих процедур изготовления ручки электродных проволок с осторожностью, поскольку очень мало силы, необходимые для их повреждению. Есть много шагов в тетрод и микро-дисков массива процедура, и каждый шаг так же важно, как другие для получения высокого качества данных. Протокол, описанный здесь, работает хорошо для нашей лаборатории учетом имеющегося оборудования. Ресурсов в собственной лаборатории могут быть разными, поэтому рассмотрим каждый шаг тщательно и не стесняйтесь менять протокол в соответствии с вашими требованиями и ограничениями для достижения оптимальной производительности.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.