Micro-drive array för kronisk In vivo Inspelning: Tetrode Assembly

Summary

I detta protokoll visar vi hur man kan tillverka och tetrodes villkor för användning med ett micro-drive array, som var utformad för kronisk elektrofysiologiska inspelningar hos råttor. Dessutom visar vi de sista stadierna av mikro-drive array konstruktion, vilket inkluderar installation av jordkablar och ett skyddande kon.

Abstract

Den tetrode, en bunt av fyra elektroder, har visat sig vara ett värdefullt verktyg för samtidig inspelning av flera nervceller in-vivo. Skillnaden amplitud aktionspotentialens signaturer över kanalerna i en tetrode gör för isolering av en enda enhet aktivitet från flera enheter signaler. Möjligheten att exakt kontrollera stereotaxic läge och djup tetrode är avgörande för att studera samordnad neural aktivitet i hjärnan. I kombination med ett micro-drive array, är det möjligt att uppnå exakt placering och stabil kontroll av många tetrodes under loppet av dagar till veckor. I detta protokoll visar vi hur man kan tillverka och skick tetrodes använda grundläggande verktyg och material, installera tetrodes till en multi-drive tetrode array för kroniska in vivo-inspelning i råtta, knyta kontakter jordledare till mikro-drive array, och bifoga en skyddande kon på mikro-drive array för att skydda tetrodes av fysisk kontakt med omgivningen.

Protocol

1. Tillverkning av tetrodes

1. Börja byggandet av en tetrode genom att erhålla en 50 cm lång, polyimid isolerad, Ni-krom tråd med en 12,5 mikron diameter kärna. Vik tråden på mitten. Kör fingrarna längs paret att få dem att hålla ihop. Se till att kabelpar har god kontakt med hela sin längd.
2. Vik ihop igen genom att hålla de två ändarna tillsammans. Se till att öglan bildas i ena änden är inte viker sig. Skär fyra trådarna på de icke-loopade slut så att de fyra tips är justerade.
3. För nästa steg, kommer du att behöva en modifierad krokodilklämmor, en motoriserad vända enhet och ett horisontellt streck ovanför vrida enheten. Krokodilklämman ändras genom limning en plast bar till basen av klippet. Där kabeln tips utsätts för, klämma de fyra trådarna tillsammans med det modifierade alligator klipp. Häng slinga av ledningar över horisontella fältet. Placera alligator klipp i motoriserade scenen.
4. Applicera 80 medsols vändningar följt av 40 räknaren medurs vrider till kabeln bunt under loppet av cirka tre minuter. Dessa parametrar kan varieras efter dina behov.
5. Efter tetrode vridning är klar, säkring trådarna ihop av värme från tre olika vinklar med en värmepistol (420 ° C eller 790 ° F), med hjälp av medel-lågt flöde. För varje vinkel, börja 1-2 cm nedanför där kabeln bunt splittringar, kör värmepistol ner och upp på en 2 cm avstånd från ledningarna i ca 5 sekunder. Var försiktig så höga temperaturer kommer att helt smälta isoleringen och leda till kortslutning.
6. Nu när ledningarna har smält ihop, ta bort tetrode från att vrida apparaten genom att försiktigt lyfta alligator clip för att lindra spänning på tetrode, och skär tetrode nära alligator klipp. I andra änden, skär slingan så att det finns fyra icke-bundna kabeltrådar lika långa.
7. Därefter separera enskilda delar i toppen genom att försiktigt böja trådarna med en mjuk tippas pincett.
8. Den tetrode är nu klar för påfyllning av mikro-drive array. Få 21 för att ytterligare 25 tetrodes och lagra dem i en dammfri box tills det är dags för tetrode lastning.

2. Fylla på tetrodes och jordledningar i mikro-drive array

1. För att fortsätta måste du ha en komplett micro-drive array. Om du ännu inte har byggt en, se videon "Micro-drive array för kroniska in-vivo inspelningen:. Driva tillverkning" I vår design plan kommer tetrode fästas i ena änden till kontakten hårdvara, och kommer att gå igenom polyimid bärare röret i mikro-enheten så att elektroden tips sträcka sig under basen av mikro-drive array.
2. Innan du börjar bygga upp en enhet hållare som kan fästas i kontakten styrelsen i ena änden och i andra änden, kan spännas fast med ett panavise. I detta exempel är enheten innehar en Mill-Max kontakt limmas ena änden av en X-Acto kniv handtaget (Figur 1c).
3. Håll tetrode med mjuka tippade pincett och använder en stereoskopet, tryck spetsen på tetrode i polyimid bärare tub av en av de mikro-enheter. Tryck tetrode i röret tills personen elektroden kablarna ligger nära kontakten ombord på toppen av enheten matrisen. Var noga med att inte vikas eller böja kablar, som kommer att orsaka tetrode att gå in i hjärnan i en vinkel, snarare än vinkelrätt, och kommer att försvaga integritet tetrode.
4. Försiktigt mata den andra änden av de fyra trådarna i sina respektive hål i elektroden gränssnittskortet med mjuka tippas pincett. Återigen, undvik skarpa böjar eller böja trådarna. Med alla fyra kablarna på plats, tryck guld stift i sina hål med en tång som har en förkortad underkäke. När stiften trycks in i hålet, kommer de band kabeln isolering och skapa en elektrisk anslutning.
5. För senare användning, hålla koll på den kartläggning mellan mikro-enheter och stift position på elektroden gränssnittskortet.
6. Fortsätt att ladda totalt 18 tetrodes. De tre återstående mikro-enheter på matrisen kommer att användas för hus referens elektroderna. Varje referens elektrod är tillverkad av ett tetrode som bara använder en av de fyra unbonded kabeländarna. För att ansluta referens elektroderna, följ lastning förfarandet men bifoga bara en av de fyra elektroderna till respektive referenselektrod stift på kontakten ombord.
7. Om du planerar multi-site inspelningar kan det vara värt att planera bort anslutningarna från tetrodes till kontakten styrelsen i förväg. Detta bör minimera risken för att justera fel tetrode under experiment.
8. När tetrode lastningen är avslutad, göra två jordkablar, en för djuret och en för skyddande konen. Skär ett 6 'lång isolerad ståltråd (text: 0,005 "diameter) och ta bort 3 mm isolering, av metall pincett, från varje ände av kabeln. Klipp ett 4"Lång isolerad ståltråd (text: 0,005" diameter). Ta bort 3 mm isolering i ena änden och 1 cm i andra änden.
9. Dra 6 "jordkabel genom hålet på sidan av mikro-drive array och upp mot gränssnittskortet. Anslut den blottade ledningar till elektroden gränssnittskortet med ett guld stift på den utsedda marken hålet. Denna tråd kommer att ansluta till djurets skalle.
10. Dra 4 "jordkabel parallellt med tidigare installerade jordledningen. Anslut den 3 mm avskalade änden till elektroden gränssnittskortet med ett guld stift på annan utsedd marken hål. Denna tråd kommer senare att anslutas till ett kon, som ska fungera som en liten Faradays bur för att reducera brus. Vi är nu färdiga att ansluta sladdar och kan fortsätta med att förfina vår tetrodes.

3. Ställa in längden på tetrodes

1. Vårt mål i denna process är att klippa alla de tetrodes så att de är något längre än djupet av målet hjärnans struktur. I vårt exempel är mikro-enheter avsedda för högst resor på 5-6 mm, tillräckligt för att nå ut till många hjärnbarkens områden och rygg hippocampus av en vuxen råtta. Först sänka alla mikro-enheter så att tetrodes maximalt exponeras. Samtidigt skär alla tetrodes till längder som är ca 5 mm längre än den önskade slutgiltiga längd med ett par skarpa fina sax.
2. För Final Cut, förbereda ett par sågtandade sax i en panavise. Klämma ett handtag med en liten vinkel nedåt och med serrations uppåt, medan den andra hanterar dinglande.
3. Nu helt dra tillbaka alla tetrodes i deras guide kanyl genom att vrida på mikro-enheter upp.
4. Med hjälp av en stereoskopet, dra ut en tetrode ut från sin kanyl. Med hjälp av en linjal, placera sågtandade saxen på önskat avstånd från guiden kanylen. Sakta och försiktigt klippa tetrode med ett enkelt handgrepp. Efter detta tetrode skurits, återkalla mikro-drive upp med 3-4mm. Upprepa processen för varje tetrode tills alla har sänkts. På denna punkt är du redo för förgyllning.

4. Förgyllning av tetrodes och kvalitetskontroll

Förgyllning av kromnickellegering tetrode trådarna är avgörande för långsiktig stabil inspelningar. Det förhindrar korrosion och förbättrar biokompatibilitet.

1. Setup impedansen meter i yttre läget och den nuvarande generatorn i DC kolla läget med ljud (figur 1d). Tryck på två leder den nuvarande generatorn till sex möjliga par kanaler inom varje tetrode, och använda ljud feedback för att avgöra om shorts finns mellan par. Om en kort finns, åter klippa tetrode med tandad sax och testa igen. Om problemet kvarstår, kasta tetrode och ersätta den.
2. När ingen shorts finns inom alla tetrodes, flytta alla mikro-enheter ner, sträcker de tetrodes så långt ut som möjligt.
3. Modifiera utrustningen konfiguration för att kontrollera elektrod impedans (Figur 1e). Nu doppa tips av alla tetrodes i ett bad av standard goldplating lösning. Guldet badet är elektriskt ansluten till den positiva ledning av impedans mätaren. Kontrollera impedansen hos den elektroden genom att trycka på minuskabeln i impedans mätaren till motsvarande stift på kontakten ombord.
4. Mät och anteckna impedansen hos varje tråd på mikro-drive array. Normala värden är 1-3 Mohm.
5. På den nuvarande generator, ställa in aktuell mellan 1-3 μA. Därefter ordentligt fast minuskabeln av impedans mätaren till stiftet på kontakten ombord. Placera utrustning till galvanisering konfiguration (Figur 1f). På impedans mätaren, snabbt växla från normal-läget, till bypass-läge, och tillbaka. När du är i bypass-läge, kommer ström passera genom tetrode och guld lösning och guld kommer att vara klädd på elektroden spetsen. Impedansen efter varje omgång av bordläggning bör vara mindre än tidigare. Upprepa den aktuella pulsen Om impedansen inte sjunka under 1 Mohm. En försiktig utbud av godtagbar impedans är 250kOhm till 350 kOhm. Om impedansen sjunker under 200 kOhm, kan det tyda på en kortslutning.
6. Om du efter upprepade pulser impedansen inte sjunker tillräckligt, kan elektrodspetsen blockeras. Re-klipp tetrode, kontrollera shorts, och upprepa gold-plating process. Om återupptagen skär inte hjälper, byt tetrode och börja om igen.
7. Efter förkromning alla tetrodes, doppa tetrode tips kortfattat i etanol, och låt dem torka i 3 till 5 minuter.
8. Test för kortslutning i tetrodes med nuvarande generatorn med tetrode tips utsätts för luft. Om en DC-anslutning mellan två eller flera elektroder av en tetrode, åter skära tetrode och plåt med guld igen.
9. Efter förgyllning av alla tetrodes är klar, tillsätt en droppe medeltjocka cyano-akrylat lim till gränssnittet mellan varje tetrode och dess polyimid slangen. Detta kommer att säkra tetrode till sin mikro-enheten och bibehålla längden på tetrode.
10. Som ett sista steg, flytta alla tetrodes i enheten genom att vrida alla skruvar upp.

5. Montera värmeskölden

Den skyddande konen syfte är att skydda mikro-enheter och den exponerade tetrode kabeln från omgivningen. Det ger också stöd för hantering vid ett experiment och minskar elektriska störningar. Vi använder en 3-D tryckt plast kotte (Referens Del I: kör tillverkning). Det är dock möjligt att göra konen från andra material, som en böjd bit av läsk kan.

1. Ta plast konen och fixa lite tejp aluminiumfolie till inre eller yttre yta.
2. Nästa, borra ett litet hål (1,5 mm i diameter) genom konen och löst fast en skruv med bricka och mutter inne i konen. Detta kommer att fungera som en elektrisk passage för jordledningen. Vi rekommenderar att du använder en 0-80 storlek skruv och bricka kombination.
3. Först in och delvis vända tre 1-72 storlek skruvar (3 / 16 inches i längd) på sidorna av konen. Med enheten utbud tillfälligt, sätta konen på enheten. Se till att både Jordledningarna sträcker sig från botten av enheten matrisen. Vira den exponerade delen av 4 "jordledaren kring en av de 1-72 skruvar flera gånger och dra åt skruven ordentligt. Säkra konen till enheten basen genom att dra åt de återstående två konen skruvar.
4. Slutligen tar 1 cm avskalade änden av den korta jordledaren och vind runt skruven, mellan folie tejp och bricka. Säkra marken genom att dra åt skruven. Nu har vi en micro-drive array som är äntligen redo för kirurgisk implantation.

6. Representativa resultat

1. Micro-drive array produktionen är nu klar. Din micro-drive array är laddad med 18 tetrodes och 3 kanaler referens. Den är inkapslad i ett skyddande kon och lock för hållbarhet. De färdiga micro-drive array med skyddande kon väger 20g till 25g i genomsnitt.
2. Den färdiga enheten array är implanteras med hjälp av vanliga kirurgiska ingrepp. Som ni ser, är enheten ansluten till en förstärkare chip och en bunt kablar som bär signalen till datainsamling hårdvara och mjukvara.

Figur 1: A) Schematisk bild av tetrode vrida konfiguration. En horisontell stapel avbryter unbonded elektroden trådar av tetrode ovanför automatiserade tetrode slingrande enhet. B) Setup för tetrode impedans mätning och elektrod plätering. Vid kontroll för kortslutning är kretsen annorlunda:. Den svarta kabeln är ansluten till en annan elektrod kanal på kontakten ombord C) En närbild av en skräddarsydd micro-drive array innehavaren verktyg. Den cylindriska Baren är en X-Acto kniv handtaget. Kontakten är en 26-stifts, tvåradiga, Mill-Max-kontakt. De två delarna binds samman med hjälp av dentala akryl. D) Konfiguration för korta kontroll. Kanal X och Kanal Y är något två olika kanaler av de fyra tetrode kanalerna. E) konfiguration för att mäta elektrodimpedans. Den aktuella källan är "off". Impedansen Mätaren är inställd på "on" och "test".) F-konfiguration för förgyllning av elektrod tips. Den aktuella källan är inställd på "på", är ljudet "på" är läge "unipolär", är DC-test "på", är aktuell inställd på 2 mikroampere.

Discussion

Detta protokoll är den andra delen av två delar protokoll: "Micro-drive array för kroniska in-vivo inspelning." Kombinationen av micro-drive array och tetrode är ett kraftfullt verktyg för att få samtidiga inspelningar av många nervceller i en vaken, beter djur beredning. Förhoppningsvis har vi gett dig all nödvändig information för att du kommer att behöva inledas eller förbättra elektrofysiologiska inspelningar i ditt eget laboratorium.

Den motoriserade tetrode twister enheten var specialdesignade och tillverkade. Vi har försett en säljare och en del nummer som gör att du kan beställa en enhet med liknande funktionalitet. Alternativt kan en motoriserad vända enhet byggas i egen regi helt enkelt genom att kombinera en motordriven roterande stavmagnet med en magnetiserad magnetomrörarstav som är kopplad till en alligator klipp, denna konfiguration skulle sannolikt kräver manuell räkning av rotationer, manuell omkastning av rotationsriktning, och manuell start / stopp.

Vissa elektrod gränssnitt styrelser inte har pin-and-hål mekanismer för att ansluta elektroden tråd. Istället kan du ha fått ett gränssnittskort som har metall stift som sträcker sig ut från kontakten ombord, t.ex. metall stift liknar dem som ofta finns på vanliga elektroniska komponenter. Redogör vi kortfattat en metod för att ansluta tetrode kanalerna till metall stift. Först, ta bort isoleringen på tips av de fyra elektroden trådar av varje tetrode. Detta sker genom att en flamma på toppen av varje elektrod så kort som möjligt med hjälp av en handhållen butan ficklampa. Skaffa krympplast som passar lätt över metall stift, och kommer att pressa stiftet tätt efter krympplast har värmts upp. Skär krympplast slangen till längden av metall stift. Använd kapillärkraften att fylla krympplast med silver färg. Sätt den exponerade spetsen på en elektrod tråden i krympplast. Skjut försiktigt krympplast över metall stift så att elektroden tråden mellan stift och väggen i krympplast. Upprepa dessa steg för de återstående tre elektroden kanaler i tetrode. Slutligen, med en sida till sida rörelse med en värmepistol, värm fyra stift som ingår i krympplast (med elektroden kablar inne i krympplast). Vid det här laget bör du ha en stabil och säker anslutning mellan tetrode och kontakten ombord.

Under alla dessa tillverkning förfaranden hantera elektroden kablar med försiktighet eftersom mycket lite kraft för att skada dem. Det är många steg i tetrode och mikro-drive array förfarande och varje steg är lika viktigt som de andra för att få data av hög kvalitet. Protokollet som beskrivs här har fungerat bra för vårt laboratorium med tanke på den utrustning som finns tillgänglig. Resurserna i ditt eget laboratorium kan vara annorlunda, därför överväga varje steg noga och tveka inte att ändra protokollet för att uppfylla dina egna krav och begränsningar för att uppnå optimal prestanda.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Panavise	Tool	Panavise	Model 301	Holds either micro-drive array or serrated scissors
Modified Xcelite 378M Pliers	Tool	Newark Inc	96F8903	For inserting connector board pins. To make, remove 2mm from one tip of the pliers.
Slow Cure Glue	Material	Great Planes (Champaign, IL)	GPMR6015	To glue the tetrode to the micro-drive
Gold Plating Solution	Material	Neuralynx Inc.	Sifco Selectron Gold NC	Contains gold particles for electroplating
Current Generator	Tool	World Precision Instruments, Inc.	A365D-B	A.K.A. Stimulus Isolator. Used to electroplate gold solution onto electrode tips.
Impedance Meter	Tool	BAK Electronics	IMP-1 / 6662 / 2788	To check impedance of electrodes
Hot Air Gun	Tool	Steinel (Germany)	HG 3002 LCD	To fuse electrodes together to make tetrode
Accu-Tek Carbofib Tip Tweezers	Tool	Aven	18768 (Pattern 304)	For handling tetrodes
Alligator Clip	Tool	Fine Science Tools	18050-35	A.K.A. Bulldog serrefine. To clip the tetrodes together during twisting
Micro Dissecting Scissors	Tool	Biomedical Research Instruments	25-1000	For general cutting of tetrode/electrode wire
Iris Toughcut Serrated Scissors	Tool	Fine Science Tools	14058-09	For final cut of tetrodes
Teflon Coated Stainless Steel Wire	Material	A-M Systems	790500	Ground wire
12.5 micron nichrome wire	Material	Kanthal Palm Coast	Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING	Polyimide coated micro-wire for making tetrodes.
Tetrode Twister	Tool	Neuralynx Inc.	Tetrode Assembly Station	Increases the speed and consistency of tetrode fabrication.
Silver Paint	Material	GC International	22-023	For connecting the micro-electrode wires of the tetrode to the connector pins (see Discussion)
X-Acto Knife Handle	Material	MSC Direct	X3001	For constructing a micro-drive holding device.
26 Pin, 2 Row Connector	Material	Mill-Max	852-10-026-30-001000	For constructing a micro-drive holding device.