Summary
この記事では、骨髄中の彼らのニッチへの造血細胞のホーミングを研究するために使用されるプロトコルについて説明します。
Abstract
ホーミングは、移植された造血細胞へ旅行し、生着または骨髄中の住居を確立することができるする現象です。様々なchemomkinesと受容体は造血幹細胞のホーミングに関与している。 [1、2]
本論文では、造血幹細胞の研究で使用される古典的なホーミングプロトコルの概要を説明します。一般に、これは、そのホーミングニーズ調査される細胞集団を分離する興味の染料でこの集団を染色し、レシピエント動物の血流中にこれらの細胞を注入する。レシピエント動物は、注射や関心の染料のための陽性の細胞のパーセンテージまたは絶対的な数について評価骨髄後所定の時間で屠殺される。最も一般的な実験的手法の一つでは、2つの遺伝的に異なる動物（野生型動物と対応するノックアウト）から造血細胞のホーミング効率が比較されます。この記事では、実験などの枠組みの中で造血細胞ホーミングプロトコルについて説明します。
Protocol
- 我々は実験で使用するセルを抽出することによりホーミング実験を始める。レシピエント動物の長い骨の隙間に全骨髄のホーミングなどC57BL/6J（WT）及びトランスジェニックいるかを確認することがWTの動物から抽出した骨髄細胞ごとに異なる場合は、この現在の実験のために我々が調べることも検討されてリゾホスファチジン受容体1（LPAR1）（KO）のためのノックアウト。
- 我々が実験を開始する前に、我々はこの実験のために必要な資料を収集します。私たちの研究室ではすべてのマウスの解剖は、細胞がレシピエント動物に移植しようとしている代わりに、 生体外分析のために使用されている場合は特に層流の組織培養フード内で行われている。私たちは、フード内ブルーシートを置くことによって始めます。必要に応じて他のオブジェクトには、ピンセットとオートクレーブされているハサミ、滅菌使い捨てメスとアルコール綿棒などがあります。私たちは、修正されたPBSと滅菌6ウェルプレートを必要とする、乳鉢、乳棒、50ccの青は円錐管と70uM使い捨てフィルターを突破した。
- 我々一WT一KOマウスを取ることから始めます。
- これらのマウスは、CO 2吸入により安楽死させ、その後5秒間isopropranolol 70％に浸漬されています。このステップでは、細胞や実験結果の収率のいずれかの妥協につながっていないマウスの毛皮で、私たちの手で目的の細胞の混入を防ぎます。
- マウスは、鉗子とはさみのペアを使用して順番に切開されています。我々は通常、ルーチンの問題として、WTマウスで始まります。小さな断片は、腹部を覆うマウスの腹側皮膚で作られ、皮膚は、手を使って拡大されます。皮膚は簡単に後肢をオフにしています。大腿骨と脛骨が、これは骨髄を大量に含んでいるとして大腿骨頭が剥がれないように注意しながら抽出されます。上肢は体幹が動かない維持しながら、単にそれらにトラクションを適用することにより、動物の胴体から切り離されます。これは一体として上肢を削除します。上腕骨は、上肢から抽出されます。
- 削除された骨を6ウェルプレートに追加されている修正されたPBS中に配置されます。変性PBSは、熱不活性化ウシ胎児血清およびEDTA、0.5M PH8の2 ccの2 mlを添加することにより行われます。この溶液をNalgene 0.45μMのフィルターを通して濾過され、少なくとも月に摂氏4度で保存することができます。
- それは正確にWTとKOの骨を識別できるようにするためにプレートのウェルにラベルを付けることが不可欠です。
- マウスの死体は削除され、オフに配置されている。
- 新しいシートは、フード内に配置され、骨は使い捨てメスを使用して掃除している。
- きれいに骨がモルタルで一度にマウスを配置されます。修正PBSの2mlを乳棒を用いてモルタルと骨が粉砕されているために追加されます。それは10でその後にと乳棒のあちこちの動きと骨が円形の回旋の動きとそれらを粉砕最初のフラグメントに重要です。私は通常、50右回り、後、50反の動きを行うので、乳鉢で残った材料は、色および変更されたPBS中で白になるまで、上に白または透明のままの材料に追加。
- 50円形の粉砕の動きのすべてのセットの後、我々は、モルタルから50 mlコニカルチューブの上に置かれた70μMのフィルターに流体を転送する。フィルタへのすべての転送後にモルタルにPBSを2mlを追加することを忘れないでください。これが細胞のアポトーシスにつながるとして試してみて、粉砕、乾燥骨をまたは任意の期間のためにそれらが乾燥したままにしたくない。
- モルタルの材料は、白色になると、フィルターの材料は、モルタルに転送され、破砕が再び実行されます。これは、フィルタのセルが浪費されないことを保証します。通常は、再び、細胞の抽出が完了している時に色の白いモルタルの材料を作るために円形の回旋の動きの1つまたは2つのセットを取ります。
- コニカルチューブ内の溶液は、現在遠心分離し（WTと別のKOマウスから細胞を維持することを忘れないでください。従って、2つの異なるチューブ（WT細胞を持つもの、KO細胞と他の）持っている。10 1200rpmで遠心分。
- 各試験管に別々のアスピレーターのピペットを使用して上清を吸引除去する。各ペレットにACK溶解緩衝液2 Ccを追加。この溶解バッファーは、滅菌する必要があります。氷上で5分間インキュベートする。
- 各チューブに変更されたPBSの8 Ccを追加。 96ウェルプレートに2つの別々のウェルに各チューブとピペットから10 ulを取る。遠心機でチューブをセットし、10分間1200rpmで、それらをスピン。
- チューブが回転している一方で、目的の細胞を運ぶ96ウェルプレートの各ウェルにtryphan青色色素の30 ULおよび変性PBS 60 ulを追加。
- 血球計算板にこの混合物10μlのを（ピペッティングでよく混ぜてください）を追加し、4つの外側の正方形のセルを数える。
- mlあたり各サンプルの細胞数は4とmultiplieで割ったため、計数した細胞の数です。100 000によるD。
- 遠心分離が完了すると、遠心機からチューブを外し、ミリリットルあたり20万細胞の濃度で、カルシウム、マグネシウムまたはLのグルタミンなしPBSで細胞を懸濁します。あなたは可能性がKO動物のためのWTと容積5mlのための容積の約5mlを持つことになります。我々はPBSを使用するこのステップ以降は、プロトコルのためにPBSを変更されません。
- 各チューブに5uMの最終濃度を達成するためにDII、細胞の染色色素を、追加してください。 10秒直ちにボルテックス。 10分間37℃でインキュベートすると光への暴露を避ける。
- 1200rpmで10分間PBSとスピンでチューブを埋める。
- 遠心後、上清を吸引し、MLあたり40万セルにPBSで細胞を懸濁します。
- 27G針（WTマウスとKOマウスは5シリンジ、5シリンジ）で1 ccのシリンジに500μlのをロード。それは、各コホートに6シリンジを準備するのが賢明かもしれません。我々は次に何をしようとしている尾静脈注射はトリッキーなことができるように余分なものを持つことに役立ちます。
- 崩壊からDIIを維持するために、アルミホイルでシリンジをカバーしています。
- 各受信者の動物への細胞の混合物を500 ulを注入し、（各コホートの5）。
- これらの動物は、4月24日時間注射前に照射の9 Gyで照射する必要があります。
- 注射後48時間、各受信者の動物の後肢から収穫の骨髄。
- ドナーのために上記のようなプロセス。 PBSの1ccのに各動物からの細胞を再懸濁します。血球計を用いて細胞数を取得します。
- BDからLSR IIフローサイトメーターまたは同等の楽器をお読みください。結果はパーセンテージまたはDII肯定的に分析骨髄中の細胞の絶対数として表現することができます。
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Discussion
それによって幹細胞、前駆細胞と分化細胞を含む骨髄細胞、それらの方法は、骨髄へのホーミングには、血流や骨髄のマウスの骨髄腔に注入された後のプロセスです。定義から明らかなように、科学者は、造血幹細胞、前駆細胞または免疫表現型によって識別されると細胞選別によって単離された分化細胞のホーミングを勉強することを選んだことがあります。一般的に科学者は、系統マーカーのために枯渇した骨髄細胞を注入し、それ故に前駆細胞および幹細胞を濃縮。
注入された目的の細胞の投与量は、この実験では変数です。細胞の数は、レシピエントマウスあたり500 000からレシピエントマウス当たり20万人に変えることができます。複数のセルが一つの骨髄で容易に検出を注入することができます。細胞数の可用性は、注入された数が制限される場合があります。 2000万LKS SLAMの細胞を選別することであってもおそらく1つは、上記所定の範囲の下端に向かって細胞の数を使用することにしたことがあるので、その場合、ほとんどの実験室の設定で現在の技術、と現実的では極めて困難である。
検討されているホーミングいるホースの動物にも変えることができます。このレシピエント動物は、我々はこの実験と同様に致死量の放射線の9グレイを照射されたWT C57BL/6Jマウス、照射されていないWT C57BL/6JマウスまたはW / WVマウスかもしれません。マウスは、照射や実験者が答えることを試みている質問に依存していないかどうか。いずれかのサイトカインが多量に放出されていると血管の漏れが誘導されている設定でホーミングの研究に興味を持っている場合は、照射WTマウスでは、適切な選択肢です。細胞（500 000）の小さい数字は、上記の交絡因子なしで幹細胞が占有されていないニッチの少数の自宅できるように照射されていないWTマウスに注入されることがあります。
W / WVマウスでは、c - KIT受容体の機能が欠損しており、任意の前処理演算子なしで幹細胞を植え付けることができる。これは、私たちは放射線によって引き起こされる血管損傷またはサイトカイン放出のない状態で幹細胞のホーミングを研究することができます。これらのマウスの使用とロジスティックの問題は、繁殖コロニーのサイズの問題のために受信者として機能するようにWWVマウスの適切な数字を得ることが困難であるということです。
簡単に言えば、我々は標準的なホーミングプロトコルを説明しているが、ばらつきは、実験の設計中に回答すると決定しなければならない問題に依存して使用。
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Acknowledgments
このプロトコルは、デビッドスカデンの研究室でテストされ最適化されていました。資金は、ダナファーバー癌研究所/マサチューセッツ総合病院臨床血液腫瘍フェローシッププログラムによって提供されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
