Summary
Este artigo descreve um protocolo usado para estudar o homing das células hematopoiéticas para seus nichos na medula óssea.
Abstract
Homing é o fenômeno pelo qual transplantadas células hematopoiéticas são capazes de viajar de e para enxertar ou estabelecer residência na medula óssea. Chemomkines vários e receptores estão envolvidos no homing das células-tronco hematopoiéticas. [1, 2]
Este documento descreve o protocolo clássico homing utilizados em estudos de células-tronco hematopoiéticas. Em geral, isso envolve isolar a população de células cuja homing precisa ser investigada, manchando esta população com um corante de juros e injetar essas células na corrente sanguínea de um animal destinatário. O animal é então destinatário sacrificados em um tempo pré-determinado após a injeção e da medula óssea avaliados para a percentagem ou número absoluto de células que são positivos para a tintura de interesse. Em um dos esquemas mais comuns experimental, a eficiência homing das células hematopoiéticas de dois animais geneticamente distintos (um animal tipo selvagem e fora knock-correspondente) é comparada. Este artigo descreve o protocolo de células hematopoiéticas homing no quadro de como o experimento.
Protocol
- Começamos a experiência homing, extraindo células para serem usadas no experimento. Para esta experiência atual que estamos interessados em descobrir se o homing de medula óssea para os nichos nos ossos longos de animais destinatário é diferente para as células extraídas da medula óssea de animais WT, como C57BL/6J (WT) e aqueles que são transgênicos nocautes para o receptor de Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO).
- Antes de iniciar o experimento, iremos recolher os materiais que precisamos para este experimento. Em nosso laboratório todas as dissecções do mouse são realizadas em um fluxo laminar de cultura de tecidos, especialmente se as células vão ser transplantados em um animal destinatário, em vez de serem utilizadas para a análise ex-vivo. Começamos colocando uma folha azul dentro do capô. Outros objetos necessários incluem um par de fórceps e uma tesoura afiada que foram autoclavados, um bisturi estéril e descartável cotonetes e álcool. Vamos precisar de PBS modificado e uma placa de 6 estéril bem, um morteiro, azul, 50cc pilão cobertas tubo cônico e um filtro 70uM descartáveis.
- Começamos por tomar um WT e um rato KO.
- Estes ratos são sacrificados por inalação de CO 2 e em seguida mergulhado em 70% isopropranolol por 5 segundos. Este passo impede a contaminação das células de interesse com pele de rato e em nossas mãos não levou a qualquer compromisso no rendimento de células ou resultados experimentais.
- Os ratos são, então, dissecado por sua vez, usando um par de pinças e tesouras afiadas. Nós geralmente começam com o mouse WT como uma questão de rotina. Um snip pequeno é feito na pele ventral do rato que cobre o abdômen e, em seguida, a pele é esticada usando as mãos. A pele sai nos membros posteriores com facilidade. O fêmur ea tíbia são, então, extraído tomando cuidado para não desalojar a cabeça do fêmur como este contém uma grande quantidade de medula óssea. Os membros superiores são destacados de torso do animal pela simples aplicação de tração para eles, mantendo o tronco imóvel. Isso remove os membros superiores como uma peça. Os úmeros são então extraídos os membros superiores.
- Os ossos retirados são colocados em PBS modificado que foi adicionado a 6 pratos bem. PBS modificado é feita pela adição de 2 ml de calor soro fetal bovino inativado e 2 cc de EDTA 0,5 M PH8. Esta solução é então filtrada através de um filtro de 0,45 uM Nalgene e pode ser armazenado a 4 graus Celsius por pelo menos um mês.
- É essencial para rotular os poços da placa, a fim de ser capaz de identificar WT e KO ossos corretamente.
- As carcaças mouse são removidos e eliminados off.
- A nova planilha é colocado no capô e os ossos são limpos usando um bisturi descartáveis.
- Os ossos limpos são colocados um rato em um momento no almofariz. Dois ml de PBS modificado é adicionado à argamassa e os ossos são esmagados utilizando um pilão. É importante primeiro fragmento dos ossos com 10 a frente e para trás dos movimentos da mão e, em seguida, pulverize-as com movimentos rotatórios circular. Eu costumo fazer 50 no sentido horário, então 50 movimentos anti-horário e assim por diante até que o material deixado na argamassa é de cor branca e do PBS modificado adicionado ao material permanece branco ou transparente.
- Depois de cada conjunto de 50 movimentos circulares esmagamento, nós transferimos o líquido da argamassa para a 70 uM filtro colocado no topo de um tubo de 50 ml. Não se esqueça de adicionar 2 ml de PBS para a argamassa depois de cada transferência ao filtro. Você não quer tentar pulverizar ossos secos ou deixe-os secar por qualquer período de tempo que isso levará a apoptose de células.
- Uma vez que o material a argamassa torna-se branco, o material do filtro é transferido para a argamassa eo esmagamento é novamente executada. Isso garante que as células do filtro não são desperdiçados. Normalmente demora um ou dois conjuntos de circular movimentos rotatórios para novamente fazer o material na argamassa na cor branca no momento em que a extração de células está completa.
- A solução no tubo cônico agora é centrifugado (lembre-se de manter as células do WT e mouse KO separado. Daí você terá dois tubos diferentes (uma com células WT, o outro com células KO). Centrifugar a 1200 rpm por 10 minutos.
- Aspirar fora do sobrenadante usando pipetas aspirador separado para cada tubo. Adicione 2 cc de tampão de lise ACK para cada pellet. Este tampão de lise deve ser estéril. Incubar no gelo por 5 minutos.
- Adicionar 8 ml de PBS modificado a cada tubo. Levar 10 ul de cada tubo e pipetar em dois poços separados em uma placa de 96 poços. Colocar os tubos na centrífuga e girá-los a 1200 rpm por 10 minutos.
- Enquanto os tubos estão girando, adicionar 30 ul de tryphan corante azul e 60 ul de PBS modificado a cada poço da placa de 96 poços que transporta as células de interesse.
- Adicionar 10 ul da mistura (por favor, misture bem por pipetagem cima e para baixo) para um hemocitômetro e contar as células nas quatro praças exterior.
- A contagem de células em cada amostra por ml é o número de células contadas, assim, dividido por 4 e multiplied por 100 000.
- Uma vez que a centrifugação for concluída, remova os tubos da centrífuga e ressuspender as células em PBS sem cálcio, magnésio ou glutamina L a uma concentração de 20 milhões de células por ml. Você provavelmente vai ter cerca de 5 ml de volume para o WT e 5 ml de volume para o animal KO. A partir desse passo, vamos estar usando PBS, PBS não modificados para o protocolo.
- A cada tubo adicionar DII, um corante de coloração de células, para alcançar uma concentração final de 5um. Vortex imediatamente por 10 segundos. Incubar a 37 graus por 10 minutos e evitar a exposição à luz.
- Encher os tubos com PBS e girar por 10 minutos a 1200 rpm.
- Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em PBS a 40 milhões de células por ml.
- Carga 500 ul em 1 cc seringas com agulha 27G (5 seringas para o mouse WT e 5 seringas para os camundongos KO). Pode ser prudente para preparar 6 seringas para cada coorte. Ter um extra pode ajudar como injeções cauda veia que vamos fazer a seguir pode ser complicado.
- Cubra com papel alumínio as seringas, a fim de manter a DII se desintegre.
- Injetar 500 ul da mistura de células em cada animal destinatário; (5 para cada coorte).
- Estes animais precisam ser irradiados com 9 Gy de irradiação 4-24 horas antes da injeção.
- 48 horas após a injeção, a medula óssea a partir da colheita de membros posteriores de cada animal destinatário.
- Processo como descrito acima para os doadores. Ressuspender as células de cada animal em 1 cc de PBS. Obter uma contagem de células utilizando um hemocitômetro.
- Leia no citômetro de fluxo LSR II da BD ou um instrumento equivalente. O resultado pode ser expressa como a percentagem ou número absoluto de células na medula óssea, que são analisados DII positivo.
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Discussion
Homing é o processo pelo qual células da medula óssea, incluindo as células-tronco, as células progenitoras e células diferenciadas, o seu caminho para a medula óssea depois de ser injetado na corrente sanguínea ou na cavidade da medula óssea de camundongos. Como é óbvio a partir da definição, um cientista pode optar por estudar o homing das células-tronco hematopoiéticas, células progenitoras ou células diferenciadas identificados por imunofenotipagem e isoladas por separação de células. Normalmente os cientistas injetam células da medula óssea esgotados para os marcadores de linhagem e, portanto, enriquecido para progenitoras e células-tronco.
A dose das células injetadas de juros é uma variável neste experimento. O número de células pode variar de 500 000 euros por rato destinatário para 20 milhões por rato destinatário. As células mais um pode injetar mais fácil a detecção na medula óssea. Disponibilidade número de celular pode limitar o número injetado. Classificação 20 milhões de células LKS SLAM é extremamente difícil, talvez até mesmo impraticável com as tecnologias atuais em configurações mais laboratório, caso em que um pode decidir usar um número de células para a extremidade inferior da escala acima.
O animal de mangueira na qual homing está sendo estudado também pode ser variada. Este animal destinatário pode ser um rato WT C57BL/6J que foi letalmente irradiados com 9 Grays de radiação, como fizemos neste experimento, a WT C57BL/6J rato ou um mouse W / Wv que não foi irradiado. Se o mouse é irradiado ou não depende da questão o pesquisador está tentando responder. Se alguém está interessado em estudar homing em um cenário onde uma grande quantidade de citocinas está sendo lançado e vazamento vascular está sendo induzido, um mouse WT irradiados é uma escolha adequada. Um número menor de células (500 000) pode ser injetado em um rato WT que não foi irradiado, para que as células-tronco pode casa para um pequeno número de nichos desocupados sem a confusão acima.
W / Wv ratos são deficientes em c-KIT função do receptor e pode enxertar células-tronco sem qualquer pré-condicionamento. Isso nos permite estudar o homing das células-tronco na ausência de lesão vascular ou a liberação de citocinas causados pela radiação. O problema de logística com o uso desses ratos é que é difícil obter um número adequado de ratos WWV para servir como destinatários devido a preocupações de reprodução tamanho da colônia.
Em resumo, apesar de descrever um protocolo padrão homing, as variações utilizadas dependem da questão a ser respondida e deve ser determinado durante a concepção do experimento.
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Acknowledgments
Este protocolo foi testado e otimizado no laboratório do Dr. David Scadden. Financiamento é fornecido pelo Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital de Clínicas de Hematologia e Oncologia do Programa Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
