Summary
Cet article décrit un protocole utilisé pour étudier le homing des cellules hématopoïétiques à leurs niches dans la moelle osseuse.
Abstract
Homing est le phénomène par lequel les cellules hématopoïétiques transplantés sont capables de se rendre et se greffent ou établir sa résidence dans la moelle osseuse. Chemomkines divers récepteurs sont impliqués dans la domiciliation des cellules souches hématopoïétiques. [1, 2]
Ce document décrit le protocole classique de homing utilisés dans les études de cellules souches hématopoïétiques. En général il s'agit d'isoler la population de cellules dont la tête chercheuse doit être étudiée, la coloration de cette population avec un colorant d'intérêt et l'injection de ces cellules dans le sang d'un animal receveur. L'animal receveur est ensuite sacrifié à un moment prédéterminé après l'injection et la moelle osseuse évaluée par le pourcentage ou le nombre absolu de cellules qui sont positifs pour la teinture d'intérêt. Dans l'un des régimes les plus courants expérimentaux, l'efficacité homing des cellules hématopoïétiques à partir de deux animaux génétiquement distinctes (un animal de type sauvage et les correspondants knock-out) est comparé. Cet article décrit le protocole de cellules hématopoïétiques homing dans le cadre de tels que l'expérimentation.
Protocol
- Nous commençons l'expérience homing en extrayant les cellules pour être utilisé dans l'expérience. Pour cette expérience actuelle nous sommes intéressés à savoir si le homing de la moelle osseuse à l'ensemble des niches dans les os longs des animaux receveurs est différent pour les cellules de moelle osseuse extraites d'animaux tels que WT C57BL/6J (WT) et ceux qui sont transgéniques KO pour le récepteur lysophosphatidique 1 (lpar1) (KO).
- Avant de commencer l'expérience, nous allons recueillir les matériaux nous avons besoin pour cette expérience. Dans notre laboratoire tous les dissections de souris sont effectuées dans une hotte à flux laminaire de culture de tissus, surtout si les cellules vont être transplantées dans un animal receveur au lieu d'être utilisé pour l'analyse ex-vivo. Nous commençons par placer une feuille bleue à l'intérieur du capot. D'autres objets nécessaires, notamment une paire de pinces et d'une paire de ciseaux qui ont été autoclavés, un bistouri stérile jetable tampons et l'alcool. Nous aurons besoin de modification du PBS et une stérile 6 plaque de bien, un mortier, un pilon, bleu 50cc surmonté tube conique et d'un filtre 70uM jetables.
- Nous commençons par prendre un WT et une souris KO.
- Ces souris sont euthanasiés par inhalation de CO 2 et ensuite trempés dans 70% isopropranolol pendant 5 secondes. Cette étape empêche la contamination des cellules d'intérêt avec la fourrure de souris et dans nos mains n'a pas mené à aucun compromis sur le rendement des cellules ou des résultats expérimentaux.
- Les souris sont ensuite disséqués à son tour à l'aide d'une paire de pinces et de ciseaux pointus. Nous commençons généralement avec la souris WT comme une affaire de routine. Une petite snip est faite dans la peau ventrale de la souris recouvrant l'abdomen et la peau est ensuite étiré à l'aide des mains. La peau se détache facilement des membres postérieurs. Le fémur et le tibia sont ensuite extraites en prenant soin de ne pas déloger la tête du fémur car il contient une grande quantité de moelle osseuse. Les membres supérieurs sont détachés du torse de l'animal en appliquant simplement la traction pour les tout en gardant le buste immobile. Cela supprime les membres supérieurs comme une seule pièce. L'humérus sont ensuite extraites à partir des membres supérieurs.
- Les os retirés sont placés dans modifiés PBS qui a été ajouté à plaque de 6 puits. Mis à jour le PBS est faite en ajoutant 2 ml de sérum inactivé de la chaleur bovine fœtale et 2 cc d'EDTA 0,5 M pH8. Cette solution est ensuite filtrée à travers un filtre Nalgene 0,45 uM et peuvent être conservés à 4 degrés Celsius pendant au moins un mois.
- Il est essentiel d'étiqueter les puits dans la plaque afin d'être en mesure d'identifier et d'os WT KO correctement.
- Les carcasses de souris sont enlevés et éliminés.
- Une nouvelle feuille est placée dans le capot et les os sont nettoyés en utilisant un scalpel jetable.
- Les os nettoyés sont placés d'une souris à un moment dans le mortier. Deux ml de PBS modifiés est ajoutée à du mortier et les os sont broyés à l'aide d'un pilon. Il est important de premier fragment de l'os avec 10 et vient des mouvements du pilon, puis de les pulvériser avec des mouvements circulaires rotatoire. Je fais habituellement 50 aiguilles d'une montre, puis 50 mouvements anti-horaire et ainsi de suite jusqu'à ce que le matériel laissé dans le mortier est de couleur blanche et le PBS modifiés ajouté à la matière reste blanc ou transparent.
- Après chaque série de 50 mouvements circulaires concassage, nous transférons le fluide de mortier à un filtre 70 uM placé sur le dessus d'un tube conique de 50 ml. Ne pas oublier d'ajouter 2 ml de PBS pour le mortier, après chaque transfert vers le filtre. Vous ne voulez pas essayer de pulvériser les os secs ou les laisser sécher pendant toute la durée du temps que cela va conduire à l'apoptose des cellules.
- Une fois le matériel dans le mortier devient blanche, la matière dans le filtre est transféré au mortier et l'écrasement est à nouveau effectuée. Cela garantit que les cellules dans le filtre ne sont pas gaspillées. Habituellement, cela prend une ou deux séries de mouvements de rotation circulaire, faire à nouveau le matériau de la blanche de mortier de couleur à ce moment de l'extraction de cellules est terminée.
- La solution dans le tube conique est désormais centrifugé (s'il vous plaît n'oubliez pas de garder les cellules de la WT et souris KO séparé. Ainsi, vous aurez deux tubes différents (l'un avec des cellules WT, l'autre avec les cellules KO). Centrifuger à 1200 rpm pendant 10 minutes.
- Aspirer le surnageant à l'aide des pipettes d'aspiration séparée pour chaque tube. Ajouter 2 cc de tampon de lyse ACK à chaque pastille. Ce tampon de lyse doivent être stériles. Incuber dans la glace pendant 5 minutes.
- Ajouter 8 cc de modification du PBS dans chaque tube. Prenez 10 ul de chaque tube et la pipette dans deux puits distincts dans une plaque 96 puits. Placer les tubes dans la centrifugeuse et les faire tourner à 1200 rpm pendant 10 minutes.
- Alors que les tubes sont la filature, ajouter 30 ul d'tryphan colorant bleu et 60 ul d'modifiés PBS dans chaque puits de la plaque de 96 puits qui transporte les cellules d'intérêt.
- Ajouter 10 ul de ce mélange (s'il vous plaît bien mélanger par pipetage de haut en bas) à un hémocytomètre et compter les cellules dans les quatre cases extérieures.
- Le nombre de cellules dans chaque échantillon par ml est le nombre de cellules ainsi compté divisé par 4 et multiplieD par 100 000.
- Une fois la centrifugation est terminée, retirez les tubes de la centrifugeuse et remettre les cellules en PBS sans calcium, de magnésium ou de la glutamine L à une concentration de 20 millions de cellules par ml. Vous aurez probablement environ 5 ml de volume pour le WT et 5 ml de volume pour l'animal KO. A partir de cette étape, nous allons utiliser le PBS, PBS pas modifié pour le protocole.
- Pour chaque tube DII, un colorant coloration des cellules, pour atteindre une concentration finale de 5um. Vortex immédiatement pour 10 secondes. Incuber à 37 degrés pendant 10 minutes et éviter l'exposition à la lumière.
- Remplir les tubes avec du PBS et de spin pendant 10 minutes à 1200 rpm.
- Après centrifugation, aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du PBS à 40 millions de cellules par ml.
- Charge 500 ul dans des seringues de 1 cc avec une aiguille 27G (5 seringues pour la souris WT et 5 seringues pour les souris KO). Il peut être prudent de se préparer 6 seringues pour chaque cohorte. Ayant un extra peut aider que les injections veine de la queue que nous allons faire ensuite peut être délicat.
- Couvrir avec une feuille de seringues afin de garder le DII de se désintégrer.
- Injecter 500 ul du mélange de cellules dans chaque animal receveur; (5 pour chaque cohorte).
- Ces animaux ont besoin d'être irradiés avec 9 Gy d'irradiation 4-24 heures avant l'injection.
- 48 heures après l'injection, la moelle osseuse à partir de récolte des membres postérieurs de chaque animal receveur.
- Procédé tel que décrit ci-dessus pour les donateurs. Resuspendre les cellules de chaque animal dans 1 cc de PBS. Obtenir une numération cellulaire en utilisant un hématimètre.
- Lire sur le cytomètre de flux LSR II de BD ou un instrument équivalent. Le résultat peut être exprimé comme le pourcentage ou le nombre absolu de cellules dans la moelle osseuse qui sont analysés DiI positif.
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Discussion
Homing est le processus par lequel les cellules de moelle osseuse, y compris les cellules souches, les cellules progénitrices et des cellules différenciées, leur chemin dans la moelle osseuse, après avoir été injecté dans le flux sanguin ou une cavité de moelle osseuse de souris. Comme il est évident à partir de la définition, un scientifique peut choisir d'étudier la domiciliation des cellules souches hématopoïétiques, les cellules progénitrices ou des cellules différenciées identifiés par immunophénotypage et isolés par tri cellulaire. Typiquement scientifiques injecter des cellules de moelle osseuse pour les marqueurs de la lignée appauvri et donc enrichi pour progénitrices et des cellules souches.
La dose des cellules de injectés intérêt est une variable dans cette expérience. Le nombre de cellules peut varier de 500 000 par souris receveuse à 20 dollars par souris receveuse. Les cellules plus on peut injecter le plus facile la détection de la moelle osseuse. Le nombre de cellules disponibles peut limiter le nombre injecté. Tri 20000000 LKS cellules SLAM est extrêmement difficile voire impossible avec les technologies actuelles dans la plupart des paramètres de laboratoire, auquel cas on pourrait décider d'utiliser un certain nombre de cellules vers l'extrémité inférieure de la fourchette indiquée ci-dessus.
L'animal le tuyau dans lequel homing est étudiée peut également être modifiée. Cet animal bénéficiaire peut être une souris WT C57BL/6J qui a été mortellement irradiées avec 9 Grays de rayonnement que nous avons fait dans cette expérience, une souris WT C57BL/6J ou une souris W / Wv qui n'a pas été irradié. Si la souris est irradié ou non dépend de la question de l'expérimentateur tente de répondre. Si on est intéressé à étudier homing dans un contexte où une grande quantité de cytokines est d'être libéré et de fuite vasculaire est induite, d'une souris irradiée WT est un choix approprié. Un plus petit nombre de cellules (500 000) peut être injecté dans une souris WT, qui n'a pas été irradié afin que les cellules souches peuvent à domicile à un petit nombre de niches inoccupées sans confusion ci-dessus.
W / Wv souris sont déficientes en fonction des récepteurs c-kit et peuvent se greffer des cellules souches sans préconditionnement. Cela nous permet d'étudier le homing des cellules souches en l'absence de lésion vasculaire ou de la libération de cytokines causés par les radiations. Le problème de logistique avec l'utilisation de ces souris, c'est qu'il est difficile d'obtenir un nombre suffisant de souris WWv pour servir en tant que bénéficiaires en raison de préoccupations d'élevage colonie de taille.
En bref, bien que nous décrivons un protocole standard à tête chercheuse, les variations utilisées dépendent de la question qui se pose et doit être déterminée lors de la conception de l'expérience.
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Acknowledgments
Ce protocole a été testé et optimisé dans le laboratoire du Dr David Scadden. Le financement est assuré par l'Institut Dana Farber Cancer / Hôpital général du Massachusetts Hématologie et d'Oncologie Programme de bourses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
