Summary
En este artículo se describe un protocolo que se utiliza para estudiar el homing de las células hematopoyéticas de sus nichos en la médula ósea.
Abstract
Homing es el fenómeno por el cual las células hematopoyéticas trasplantadas son capaces de viajar y se injertan o establecer su residencia en la médula ósea. Chemomkines diversos y receptores están implicados en el homing de las células madre hematopoyéticas. [1, 2]
Este documento describe el protocolo clásico homing utilizadas en estudios de células madre hematopoyéticas. En general, esto consiste en aislar la población de células cuyas necesidades homing para ser investigados, la tinción de esta población con un tinte de interés e inyectar estas células en el torrente sanguíneo de un animal receptor. El animal receptor entonces se sacrificó en un tiempo predeterminado después de la inyección y la médula ósea para evaluar el porcentaje o el número absoluto de células que son positivas para el tinte de interés. En uno de los proyectos experimentales más comunes, la eficiencia de homing de las células hematopoyéticas de dos animales genéticamente distintas (un animal de tipo salvaje y el knock-out correspondiente) es comparada. En este artículo se describe el protocolo de células hematopoyéticas de recalada en el marco de como experimento.
Protocol
- Al comenzar el experimento mediante la extracción de células mensajeras para ser utilizado en el experimento. Para este experimento actual que estamos interesados en saber si la recalada de toda la médula ósea de los nichos en los huesos largos de los animales receptores es diferente para las células de la médula ósea extraídas de animales WT como C57BL/6J (WT) y los que son transgénicos KO para el receptor de lisofosfatídico 1 (LPAR1) (KO).
- Antes de empezar el experimento, vamos a recoger los materiales que necesitamos para este experimento. En nuestro laboratorio de todas las disecciones del ratón se llevan a cabo en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos, especialmente si las células se van a trasplantar a un animal receptor en lugar de ser utilizados para el análisis ex-vivo. Empezamos poniendo una hoja de color azul dentro de la campana. Otros objetos necesarios incluyen un par de pinzas y un par de tijeras afiladas que se han autoclave, una solución estéril de bisturí desechable hisopos y alcohol. Tendremos que modificar PBS estéril y un 6 y placa, un mortero, maja azul, 50cc tubo cónico cubierto y un filtro desechable 70uM.
- Comenzamos con un TE y un ratón KO.
- Estos ratones son sacrificados por inhalación de CO 2 y se sumergen en un 70% isopropranolol durante 5 segundos. Este paso evita la contaminación de las células de interés con la piel del ratón y en nuestras manos, no ha dado lugar a ningún tipo de compromiso en el rendimiento de las células o los resultados experimentales.
- Los ratones se diseca a su vez con un par de pinzas y tijeras afiladas. Por lo general, comienzan con el ratón WT como una cuestión de rutina. Un recorte pequeña en la piel ventral del ratón que recubre el abdomen y la piel se estira con las manos. La piel se desprende con facilidad las extremidades posteriores. El fémur y la tibia se extraen con cuidado de no desplazar la cabeza del fémur, ya que contiene una gran cantidad de médula ósea. Las extremidades superiores se desprenden de torso del animal mediante la simple aplicación de tracción para, manteniendo el torso inmóvil. Esto elimina las extremidades superiores como una sola pieza. El húmero se extraen de los miembros superiores.
- Los huesos extraídas se colocan en PBS modificado que se ha añadido a 6 placas. Modificado PBS se hace mediante la adición de 2 ml de inactivado por calor suero fetal bovino y 2 ml de EDTA 0,5 M pH 8. Esta solución se filtra a través de un filtro Nalgene de 0,45 m y se puede almacenar a 4 grados Celsius durante al menos un mes.
- Es esencial para etiquetar los pozos de la placa con el fin de ser capaces de identificar los huesos WT y KO correctamente.
- Los cadáveres del ratón son retirados y eliminados fuera.
- Una nueva hoja se coloca en el capó y los huesos se limpian con un bisturí desechable.
- Los huesos limpios se coloca un ratón en un momento en el mortero. Dos ml de PBS modificado se añade al mortero y los huesos se trituran con un mortero. Es importante que el primer fragmento de los huesos con 10 movimientos de un lado a otro de la mano del mortero y luego pulverizarlos con movimientos circulares rotatorios. Yo suelo hacer 50 las agujas del reloj, de 50 movimientos en sentido contrario y así sucesivamente hasta que el material que queda en el mortero es de color blanco y el SBP modificado, añadido al material permanece de color blanco o transparente.
- Después de cada juego de 50 movimientos circulares de trituración, que transfiera el líquido de la argamasa de un filtro de 70 uM colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. No te olvides de añadir 2 ml de PBS para el mortero después de cada transferencia al filtro. Usted no quiere tratar de pulverizar los huesos secos o dejarlas secar durante un período de tiempo ya que esto dará lugar a la apoptosis de las células.
- Una vez que el material en el mortero se convierte en blanco, el material en el filtro se transfiere a los morteros y la trituración se realiza de nuevo. Esto asegura que las células en el filtro no se desperdicien. Normalmente se tarda uno o dos juegos de circular movimientos rotatorios para hacer de nuevo el material en el blanco de mortero en color y en ese momento de la extracción de las células es completa.
- La solución en el tubo cónico está centrifugada (por favor, recuerde que debe mantener las células de los ratones WT y KO por separado. Por lo tanto, tendrá dos tubos diferentes (uno con las células WT y la otra con células KO). Centrifugar a 1200 rpm durante 10 minutos.
- Aspirar el sobrenadante utilizando pipetas separadas para cada tubo aspirador. Añadir 2 ml de solución amortiguadora de lisis ACK para cada pastilla. Esta solución amortiguadora de lisis debe ser estéril. Incubar en hielo durante 5 minutos.
- Añadir 8 cc de modificar PBS a cada tubo. Tomar 10 ul de cada tubo y la pipeta en dos pozos separados en una placa y 96. Colocar los tubos en la centrífuga y el giro que a 1200 rpm durante 10 minutos.
- Mientras que los tubos están girando, añadir 30 ul de tryphan colorante azul y 60 ul de PBS modificado en cada pocillo de la placa de 96 y que lleva a las células de interés.
- Añadir 10 ul de la mezcla (por favor, mezclar bien con la pipeta hacia arriba y abajo) en un hemocitómetro y contar las células en las cuatro plazas exteriores.
- El recuento de células en cada muestra por ml es el número de células así contado, dividido por 4 y multiplied por 100 000.
- Una vez que la centrifugación, retire los tubos de la centrífuga y resuspender las células en PBS sin calcio, magnesio o la glutamina L a una concentración de 20 millones de células por ml. Es probable que tenga unos 5 ml de volumen para el WT y 5 ml de volumen para que el animal KO. A partir de este paso vamos a utilizar PBS, sin modificar el protocolo para la PBS.
- A cada tubo agregar DII, un colorante de tinción de células, para lograr una concentración final de 5 um. Vortex inmediatamente por 10 segundos. Se incuba a 37 grados durante 10 minutos y evitar la exposición a la luz.
- Llenar los tubos con PBS y girar durante 10 minutos a 1200 rpm.
- Después de la centrifugación, se aspira el sobrenadante y resuspender las células en PBS a 40 millones de células por ml.
- Carga de 500 ul en jeringas de 1 cc con una aguja 27G (5 jeringas para el ratón WT y 5 jeringas para los ratones KO). Puede ser prudente para preparar 6 jeringas para cada cohorte. Tener uno extra puede ayudar a que las inyecciones de vena de la cola que vamos a hacer a continuación puede ser complicado.
- Cubrir las jeringas con papel de aluminio con el fin de mantener el DII de la desintegración.
- Inyectar 500 ul de la mezcla de células en cada animal receptor, (5 para cada cohorte).
- Estos animales deben ser irradiados con 9 Gy de irradiación de 4-24 horas antes de la inyección.
- 48 horas después de la inyección, la médula ósea de la cosecha de las extremidades posteriores de cada animal receptor.
- Proceso como se describe anteriormente para los donantes. Resuspender las células de cada animal en 1 cc de PBS. Obtener un recuento de células con un hemocitómetro.
- Leer en el citómetro de flujo LSR II de BD o un instrumento equivalente. El resultado puede ser expresado como el porcentaje o el número absoluto de células en la médula ósea que son analizados DII positivo.
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Discussion
Homing es el proceso mediante el cual las células de la médula ósea como células madre, células progenitoras y las células diferenciadas, su camino en la médula ósea después de ser inyectadas en el torrente sanguíneo o en la cavidad de la médula ósea de ratones. Como se desprende de la definición, un científico puede optar por estudiar el homing de las células madre hematopoyéticas, las células progenitoras o células diferenciadas identificadas por inmunofenotipo y aislado por la clasificación de células. Normalmente, los científicos inyectan células de médula ósea agotado para marcadores de linaje y por lo tanto, enriquecido por las células progenitoras o madre.
La dosis de las células inyectadas de interés es una variable en este experimento. El número de células puede variar de 500 000 por ratón receptor a 20 millones por ratón receptor. Las células más se puede inyectar más fácil la detección en la médula ósea. Disponibilidad del número de células puede limitar el número inyectado. Clasificación 20 millones LKS células SLAM es extremadamente difícil incluso inviable con las tecnologías actuales en la mayoría de los ajustes de laboratorio, en cuyo caso se puede optar por utilizar un número de células en el extremo inferior del rango indicado anteriormente.
El animal en el que la manguera de recalada se está estudiando también puede variar. Este animal receptor puede ser un ratón PESO C57BL/6J que ha sido irradiados letalmente con 9 Grises de la radiación como lo hicimos en este experimento, un ratón PESO C57BL/6J o un ratón W / Wv que no ha sido irradiado. Si el ratón es irradiado o no depende de la pregunta el investigador está tratando de responder. Si uno está interesado en el estudio de recalada en un entorno donde una gran cantidad de citocinas liberadas y fuga vascular es inducido es, un ratón irradiado PESO es una opción apropiada. Un menor número de células (500 000) se puede inyectar en un ratón PESO que no ha sido irradiado a fin de que las células madre de origen puede que un pequeño número de nichos sin ocupar sin la confusión anterior.
W / Wv ratones deficientes en la función del receptor c-KIT y puede injertar células madre sin ningún tipo de acondicionamiento previo. Esto nos permite estudiar las mensajeras de las células madre en la ausencia de lesiones vasculares o la liberación de citoquinas causado por la radiación. El problema de logística con el uso de estos ratones es que es difícil obtener un número suficiente de ratones WWV para servir como receptores debido a problemas de tamaño de las colonias de cría.
En resumen, aunque se describe un protocolo estándar de recalada, las variaciones de utilizar depende de la pregunta a responder y se debe determinar durante el diseño del experimento.
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Acknowledgments
Este protocolo ha sido probado y optimizado en el laboratorio del Dr. David Scadden. El financiamiento es provisto por el Dana Farber Cancer Institute / Hospital General de Massachusetts Clínica de Hematología y Oncología del Programa de Becas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
