Summary
Dit artikel beschrijft een protocol dat wordt gebruikt om de homing van hematopoietische cellen om hun niches studie in het beenmerg.
Abstract
Homing is het fenomeen waarbij getransplanteerde hematopoietische cellen zijn in staat om te reizen naar en inenten of verblijf in het beenmerg vast te stellen. Verschillende chemomkines en receptoren betrokken zijn bij de homing van hematopoietische stamcellen. [1, 2]
Dit document schetst de klassieke homing protocol dat wordt gebruikt in hematopoietische stamcellen studies. In het algemeen gaat het om het isoleren van de celpopulatie die homing dient te worden onderzocht, vlekken deze populatie met een kleurstof van belang en het injecteren van deze cellen in de bloedbaan van een ontvanger dier. De ontvanger dier wordt dan opgeofferd op een vooraf bepaalde tijd na de injectie en het beenmerg geëvalueerd voor het percentage of absolute aantal cellen die positief zijn voor de kleurstof van belang. In een van de meest voorkomende experimentele regelingen, het homing efficiëntie van hematopoietische cellen van twee genetisch verschillende dieren (een wild-type dier en de bijbehorende knock-out) wordt vergeleken. Dit artikel beschrijft de hematopoietische cellen homing-protocol in het kader van, zoals experiment.
Protocol
- We beginnen de homing experiment door extractie-cellen te worden gebruikt in het experiment. Voor deze huidige experiment zijn we geïnteresseerd in het vinden van wanneer de homing van hele beenmerg om de niches in de lange botten van de ontvanger dieren is verschillend voor beenmergcellen uit WT dieren, zoals C57BL/6J (WT) en die zijn transgene uitsparingen voor Lysophosphatidic Receptor 1 (LPAR1) (KO).
- Voordat we beginnen met het experiment, zullen we verzamelen van de materialen die we nodig hebben voor dit experiment. In ons lab al de muis ontledingen worden uitgevoerd in een laminaire stroming weefselkweek kap vooral als de cellen zullen worden getransplanteerd naar een ontvanger in plaats van dier wordt gebruikt voor ex-vivo analyse. We beginnen met het plaatsen van een blauw laken in de kap. Andere benodigde objecten zijn een pincet en een scherpe schaar die zijn autoclaaf, een steriele disposable scalpel en alcoholdoekjes. We zullen aangepast PBS en een steriele 6 wells plaat, een vijzel nodig, stamper, 50cc blauw bedekt conische buis en een 70uM wegwerp filter.
- We beginnen met het nemen van een WT en een KO muis.
- Deze muizen zijn gedood door de CO 2 inademing en vervolgens ondergedompeld in 70% isopropranolol gedurende 5 seconden. Deze stap voorkomt vervuiling van de cellen van belang met de muis bont en in onze handen heeft niet geleid tot een compromis in de opbrengst van cellen of experimentele resultaten.
- De muizen worden vervolgens ontleed op hun beurt met behulp van een tang en scherpe schaar. We beginnen meestal met de WT muis als een kwestie van routine. Een kleine snip is gemaakt in de ventrale huid van de muis bovenliggende de buik en de huid wordt dan opgerekt met behulp van de handen. De huid komt uit de achterste ledematen gemakkelijk. Het dijbeen en scheenbeen worden geëxtraheerd zorg niet aan de kop van het dijbeen te verdrijven, omdat dit bevat een grote hoeveelheid beenmerg. De bovenste ledematen zijn losgemaakt van de romp van het dier door gewoon toe te passen tractie aan hen, terwijl het houden van de romp bewegen. Dit verwijdert de bovenste ledematen als een stuk. De humeri worden vervolgens onttrokken aan de bovenste ledematen.
- De verwijderde beenderen zijn geplaatst in gewijzigde PBS die is toegevoegd aan 6 well platen. Gewijzigd PBS wordt gemaakt door toevoeging van 2 ml van de warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 2 cc EDTA 0,5 M pH8. Deze oplossing wordt vervolgens gefilterd door een Nalgene 0,45 uM filter en kan worden opgeslagen bij 4 graden Celsius gedurende tenminste een maand.
- Het is essentieel om de putten label in de plaat om correct te kunnen identificeren WT en KO botten.
- De muis karkassen worden verwijderd en afgevoerd.
- Een nieuw blad wordt geplaatst in de motorkap en de botten worden gereinigd met behulp van een disposable scalpel.
- De gereinigde botten worden geplaatst een muis op een moment in de mortel. Twee ml gemodificeerde PBS wordt toegevoegd aan de mortel en de botten worden gebroken met behulp van een stamper. Het is belangrijk om eerste fragment van de botten met 10 heen en weer bewegingen van de stamper en ze vervolgens te verpulveren met een cirkelvormige draaiende bewegingen. Meestal doe ik 50 met de klok mee, dan 50 tegen de klok in beweging en zo verder tot het materiaal nog in de mortel is wit van kleur en de gewijzigde PBS toegevoegd aan het materiaal blijft wit of transparant.
- Na elke set van 50 ronde verpletterende bewegingen, dragen we de vloeistof van de mortel tot een 70 uM filter geplaatst op de top van een 50 ml conische buis. Vergeet niet om 2 ml PBS toe te voegen aan de mortel na elke over te dragen aan het filter. U wilt niet om te proberen en verpulveren dorre beenderen of ze droog laten voor enige tijd, omdat dit zal leiden tot apoptose van cellen.
- Zodra het materiaal in de vijzel wit wordt, wordt het materiaal in het filter naar de mortel en de verpletterende wordt opnieuw uitgevoerd. Dit zorgt ervoor dat de cellen in het filter niet worden verspild. Meestal duurt het een of twee sets van circulaire ronddraaiende bewegingen weer maken het materiaal in de mortel wit in kleur op welk moment de extractie van de cellen is voltooid.
- De oplossing in de conische buis is nu gecentrifugeerd (vergeet dan niet om de cellen van de WT en KO muis gescheiden te houden. Vandaar dat u twee verschillende buizen (een met WT-cellen, de andere met KO cellen). Centrifugeer hebben bij 1200 rpm gedurende 10 minuten.
- Aspireren uit de bovendrijvende gebruik van afzonderlijke aspirator pipetten voor elke buis. Voeg 2 cc van ACK lysis buffer aan elke pellet. Dit lysis buffer moet steriel zijn. Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
- Voeg 8 cc van gemodificeerde PBS aan elke buis. Neem 10 ul van elk buisje en de pipet in twee afzonderlijke putten in een 96 wells plaat. Plaats de buizen in de centrifuge en spin ze op 1200 rpm gedurende 10 minuten.
- Terwijl de buizen zijn spinning, voeg 30 ul van tryphan blauwe kleurstof en 60 ul van gemodificeerde PBS aan elk putje van de 96 wells plaat dat de cellen van belang draagt.
- Voeg 10 ul van dit mengsel (gelieve goed te mengen door en neer te pipetteren) om een hemocytometer en tellen van de cellen in de vier buitenste pleinen.
- Het aantal cellen in elk monster per ml is het aantal cellen geteld dus gedeeld door 4 en multiplied door 100 000.
- Zodra het centrifugeren is voltooid, verwijdert u de buizen uit de centrifuge en resuspendeer de cellen in PBS zonder calcium, magnesium of L glutamine bij een concentratie van 20 miljoen cellen per ml. Je zal ongeveer 5 ml van volume waarschijnlijk voor de WT en 5 ml van het volume voor de KO dier. Vanaf deze stap verder zullen we met behulp van PBS, niet gewijzigd PBS voor het protocol.
- Aan elke buis toe te voegen Dii, een cel beitsen kleurstof, tot een uiteindelijke concentratie van 5UM te bereiken. Vortex onmiddellijk gedurende 10 seconden. Incubeer bij 37 graden gedurende 10 minuten en vermijd blootstelling aan licht.
- Vul de buizen met PBS en spin gedurende 10 minuten bij 1200 rpm.
- Na het centrifugeren, het supernatans aspireren en resuspendeer de cellen in PBS op 40 miljoen cellen per ml.
- Belasting 500 ul in een cc spuiten met een 27G naald (5 spuiten voor de WT muis en 5 spuiten voor de KO muizen). Het kan verstandig om 6 spuiten voor te bereiden op elk cohort. Het hebben van een extra kan helpen als staartader injecties die we gaan doen kan lastig zijn.
- Dek de spuiten met folie om de DII te houden van elkaar te vallen.
- Injecteer 500 ul van de cel mengsel in elke ontvanger dier (5 voor elk cohort).
- Deze dieren dienen te worden bestraald met 9 Gy bestraling van 4 tot 24 uur voorafgaand aan de injectie.
- 48 uur na de injectie, oogst beenmerg van de achterste ledematen van elke ontvanger dier.
- Werkwijze zoals hierboven beschreven voor de donoren. Resuspendeer de cellen van elk dier in een cc van PBS. Verkrijgen van een celgetal met behulp van een hemacytometer.
- Lees op de LSR II flowcytometer van BD of een gelijkwaardig instrument. Het resultaat kan worden uitgedrukt als het percentage of absoluut aantal cellen in het beenmerg geanalyseerd die DII positief.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Homing is het proces waarbij beenmergcellen waaronder stamcellen, progenitor cellen en gedifferentieerde cellen, hun weg naar het beenmerg na injectie in de bloedbaan of het beenmerg holte van muizen. Zoals blijkt uit de definitie, kan een wetenschapper ervoor gekozen om de homing van hematopoietische stamcellen, progenitorcellen of gedifferentieerde cellen geïdentificeerd door immunofenotypering en geïsoleerd door celsortering te bestuderen. Typisch wetenschappers injecteren beenmergcellen uitgeput voor lineage markers en daarmee verrijkt van voorlopercellen en stamcellen.
De dosis van de cellen van belang ingespoten is een variabele in dit experiment. Het aantal cellen kan variëren van 500 000 per ontvanger muis tot 20 miljoen per ontvanger muis. Hoe meer cellen kan men injecteren hoe makkelijker de detectie in het beenmerg. Aantal cellen beschikbaarheid kan beperken geïnjecteerd het nummer. Sorteren 20000000 LKS SLAM cellen is uiterst moeilijk misschien zelfs onpraktisch met de huidige technologieën in de meeste laboratoria de instellingen, in welk geval men zou kunnen besluiten om een aantal cellen te gebruiken aan de onderkant van de reeks hierboven gegeven.
De slang dier waarbij homing wordt bestudeerd kan ook worden gevarieerd. Dit dier kan een ontvanger WT C57BL/6J muis die dodelijk is bestraald met 9 Grays van straling zoals wij gedaan hebben in dit experiment, een WT C57BL/6J muis of een W / Wv muis die niet is bestraald worden. Of de muis is bestraald of niet hangt af van de vraag die de onderzoeker probeert te beantwoorden. Indien men geïnteresseerd is in het bestuderen van homing in een omgeving waar een grote hoeveelheid cytokines wordt vrijgegeven en vasculaire lekkage is veroorzaakt, een bestraald WT muis is een goede keuze. Een kleiner aantal cellen (500 000) kan worden geïnjecteerd in een WT muis die niet zo is bestraald, dat de stamcellen kunnen thuis van een klein aantal onbezette niches zonder de hierboven confounders.
W / Wv muizen deficiënt in c-KIT-receptor functie en kunnen inenten stamcellen zonder enige preconditionering. Dit laat ons toe om de homing van stamcellen bestuderen in de afwezigheid van vasculaire letsel of cytokine-afgifte veroorzaakt door straling. De logistieke probleem met het gebruik van deze muizen is dat het moeilijk is om te beschikken over adequate nummers van WWV muizen om te dienen als ontvangers te wijten aan broedkolonie grootte betreft.
Kortom, hoewel we een standaard-homing protocol te beschrijven, de variaties die afhangen van de vraag die moet worden beantwoord en dient te worden bepaald tijdens het ontwerp van het experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit protocol werd getest en geoptimaliseerd in het laboratorium van Dr David Scadden. De financiering wordt verstrekt door het Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital Klinische hematologie en oncologie Fellowship Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
