Summary
本文介绍了用于研究对他们龛的造血干细胞归巢于骨髓的协议。
Abstract
寻的是现象，使移植的造血干细胞是能够前往和嫁接，或建立在骨髓居住。各种chemomkines和受体参与造血干细胞归巢。 [1，2]
本文概述了经典的寻的协议，用于造血干细胞的研究。在一般情况下，这种分离的细胞群的寻的需求进行调查，人口与利益的染料染色和收件人的动物的血液流注入这些细胞。收件人的动物，然后牺牲在一个预先确定的时间，注射后和骨髓的细胞，这些细胞染料的利益积极的百分比或绝对数量评估。在最常见的实验计划，从两个不同的动物基因造血干细胞（野生型动物和相应的基因敲除）的归巢效率是相比。本文介绍了归巢的造血干细胞作为实验的框架协议。
Protocol
- 我们开始提取在实验中使用的细胞归巢的实验。对于这个目前的实验中，我们感兴趣的是找出如果收件人动物长骨龛的全骨髓寻的是不同的从野生型动物，如C57BL/6J（WT）中提取的骨髓细胞和那些转基因为溶血磷脂受体1（LPAR1）（KO）击倒。
- 在我们开始实验之前，我们将收集的材料，我们这个实验的需要。所有的鼠标在我们的实验室进行解剖是在层流组织培养罩，尤其是当细胞将被移植到收件人的动物，而不是被用于体外分析。我们开始放置一个蓝色的纸罩内。所需的其他对象包括一个钳和一双一双已灭菌的剪刀锋利，一次性无菌手术刀和酒精棉签。我们将需要修改后的PBS和无菌6孔板，一枚迫击炮弹，杵，50CC蓝色荣登锥形管和一个70uM的一次性过滤器。
- 我们开始考虑一个WT和一个正鼠标。
- 这些老鼠是安乐死CO 2吸入，然后蘸在5秒isopropranolol 70％。此步骤可防止用鼠标在我们手中的毛皮和利益细胞的污染并没有导致任何妥协细胞或实验结果的收益。
- 然后解剖老鼠是在使用一对钳和锋利的剪刀之交我们通常开始与野生型小鼠作为例行公事。腹侧皮肤鼠标覆的腹部皮肤，然后使用手伸在一个小剪断。关闭后肢的皮肤很容易产生。股骨和胫骨，然后照顾不打跑股骨的头部，因为这包含了大量的骨髓中提取的。简单地应用牵引，同时保持躯干不动，上肢脱离动物的躯干。这将删除一块上肢。然后提取上肢的肱骨。
- 删除骨骼被放置在改良PBS已加入到6孔板。 PBS是修改加入2毫升热灭活胎牛血清和2毫升EDTA的0.5 mol PH8。该解决方案，然后通过一个NALGENE 0.45 UM过滤器和过滤，可在4摄氏度保存至少一个月。
- 它是必不可少的标签板的井，以便能够正确识别WT和KO骨骼。
- 鼠标壳拆除和处置。
- 一个新的工作表被放置在引擎盖和骨头都使用一次性手术刀清理。
- 洗干净的骨头都放在一个鼠标，在砂浆的时候。改性PBS毫升添加到砂浆使用杵和骨头被压碎。 10至杵来回运动，然后骨头粉碎圆形旋转运动，它是重要的第一个片段。我平时50顺时针，然后逆时针旋转50运动，等等，直到留在砂浆材料是白色的颜色和修改后的PBS的材料仍然是白色或透明。
- 每50圆形的破碎动作后，我们将流体从砂浆一个50毫升的锥形管上放置一个70微米过滤器。不要忘记添加转移到过滤器后，每2毫升的PBS砂浆。你不想尝试和粉碎干燥的骨骼或离开他们干任何时间的长短，因为这会导致细胞凋亡。
- 在砂浆材料一旦变为白色，过滤材料转移到迫击炮和破碎再次执行。这将确保在过滤器中的细胞不被浪费。通常需要一个或两个圆形旋转运动再次使材料在砂浆的颜色白色，而此时的细胞提取完成。
- 在锥形管的解决方案是离心（请记住保持WT和KO鼠标单独的细胞。因此，你将有两个不同的管（与WT细胞，正细胞）。离心机1200转10分钟。
- 每个管单独使用吸引器吸液管吸上清。 ACK裂解液中加入2毫升，每个颗粒。此裂解液应无菌。在冰上孵育5分钟。
- 每管加入8毫升改性PBS。考虑到在96孔板中的两个单独的井从每管10 UL和吸管。放置在离心管和旋转10分钟1200转。
- 虽然管旋转，添加30 tryphan蓝色染料改性PBS和60 UL UL以及每96孔板中进行细胞。
- 10 UL这种混合物（请混合移液器向上和向下），血球计数细胞外的四个广场。
- 在每个样本每毫升的细胞计数，从而计算细胞数目除以4和multiplieD的100 000。
- 离心完成后，取出离心管和无钙，镁或L谷氨酰胺的浓度每毫升20万细胞的PBS重悬细胞。您将有可能为高山动物的WT和5毫升的体积约5毫升的体积。从这一步开始，我们将用PBS，不修改该协议的PBS。
- 每管添加DII，细胞染色的染料，达到5um的最终浓度。涡立即为10秒。孵育10分钟，在37度，并避免暴露在光线下。
- 填充管，用PBS和自旋为10分钟1200转。
- 离心后，吸上清，在PBS重悬在每毫升40万细胞的细胞。
- 1毫升注射器装入一个27G的针头（WT鼠标和5 KO小鼠注射器注射器）500 UL。这可能是审慎的准备为每个队列6注射器。有一个额外的帮助，为我们下一步准备做的尾静脉注射可能会非常棘手。
- 用铝箔覆盖的注射器，以保持从瓦解的直接投资收益。
- 注入到每个收件人的动物细胞混合UL 500;（5）每个队列。
- 这些动物需要4-24小时注射前9戈瑞的辐射照射。
- 注射后48小时，收获从每个收件人动物的后肢骨髓。
- 过程描述了上面的捐助者。从每个动物的细胞在1毫升的PBS重悬。获取一个细胞计数使用hemacytometer。
- 阅读屋宇署的LSR II流式细胞仪或等效的仪器。可以表示为在分析骨髓细胞的百分比或绝对数量DII积极结果。
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Discussion
寻的是过程中，骨髓细胞，包括干细胞，祖细胞分化的细胞，他们被注射进入血液流或小鼠骨髓腔后，进入骨髓。由于从定义是明显的，科学家可能选择研究造血干细胞，祖细胞分化的细胞或确定的免疫表型和细胞分选分离的归巢。通常科学家贫宗族标记注入骨髓细胞和祖细胞和干细胞丰富。
利益注入细胞的剂量是在这个实验中的变量。细胞的数量可以改变每个收件人鼠标从500万到20万每个收件人鼠标。可以注入更多的细胞在骨髓更容易检测。细胞数量的可用性可能会限制注射的人数。排序20万李嘉诚SLAM细胞是非常困难的甚至在大多数实验室设置在目前的技术，在这种情况下，可能会决定对上述范围的低端使用的细胞数量是不切实际的。
在这寻的是正在研究的软管动物也可以是多种多样的。此收件人的动物，可能是一个野生型C57BL/6J小鼠已致死剂量照射辐射与9灰色，正如我们在本实验中，一个野生型C57BL/6J小鼠或没有被照射的W / WV小鼠。鼠标是否是辐照与否取决于实验者试图回答的问题。如果一个人是在被释放大量的细胞因子和血管渗漏引起的环境中学习归巢感兴趣，辐照的WT鼠标是一个合适的选择。数量较少的细胞（500 000）可注射成WT小鼠的干细胞可以回家一个无人居住的壁龛少数没有上述混杂因素尚未照射。
W / WV小鼠c - kit受体功能不足，可以嫁接干细胞没有任何预处理。这使得我们可以由辐射引起的血管损伤或细胞因子释放的情况下在研究干细胞的归巢。使用这些小鼠的后勤问题是，它是很难获得足够数量的WWV小鼠作为受助人由于繁殖地的大小问题。
简言之，尽管我们描述了一个标准的归巢的协议，在变化时要回答问题，在实验的设计，必须确定使用依赖。
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Acknowledgments
这个协议进行了测试，并在实验室博士大卫Scadden进行了优化。 Dana Farber癌症研究所/麻省总医院临床血液学和肿瘤学奖学金计划提供资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
