Summary
Questo articolo descrive un protocollo utilizzato per studiare l'homing delle cellule ematopoietiche alla loro nicchie nel midollo osseo.
Abstract
Homing è il fenomeno per cui trapiantato cellule ematopoietiche sono in grado di viaggiare da e per innestare o stabilire la residenza nel midollo osseo. Chemomkines vari recettori sono coinvolti nella homing delle cellule staminali ematopoietiche. [1, 2]
Questo documento descrive il protocollo classico homing utilizzati negli studi di cellule staminali ematopoietiche. In generale si tratta di isolare la popolazione di cellule il cui homing ha bisogno di essere indagato, colorazione questa popolazione con un colorante di interesse e iniettando queste cellule nel sangue di un animale destinatario. L'animale destinatario è poi sacrificata a un pre-determinato tempo dopo l'iniezione e il midollo osseo per valutare la percentuale o il numero assoluto di cellule che sono positivi per la tintura di interesse. In uno degli schemi più comuni sperimentale, l'efficienza di homing delle cellule ematopoietiche da due animali geneticamente distinte (un tipo di animale selvatico e il corrispondente knock-out) è confrontato. Questo articolo descrive il protocollo di homing delle cellule ematopoietiche nel quadro di come esperimento.
Protocol
- Iniziamo l'esperimento homing con l'estrazione di cellule da utilizzare per l'esperimento. Per questo esperimento in corso siamo interessati a scoprire se l'homing di midollo osseo intero le nicchie nelle ossa lunghe degli animali beneficiari è differente per le cellule del midollo osseo viene quindi prelevato da animali WT come C57BL/6J (WT) e quelli che sono transgenici fori per il recettore Lysophosphatidic 1 (LPAR1) (KO).
- Prima di iniziare l'esperimento, che raccoglierà i materiali di cui abbiamo bisogno per questo esperimento. Nel nostro laboratorio tutte le dissezioni del mouse sono svolte in una cappa flusso laminare cultura dei tessuti, soprattutto se le cellule stanno per essere trapiantate in un animale destinatario, invece di essere utilizzato per l'analisi ex-vivo. Si comincia mettendo un foglio blu all'interno della cappa. Altri oggetti sono necessari un paio di pinze e un paio di forbici affilate che sono stati sterilizzati in autoclave, un tampone sterile monouso bisturi e alcol. Avremo bisogno modificato PBS e una sterile 6 pozzetti, un mortaio, pestello, blu 50cc superato tubo conico e un filtro 70uM usa e getta.
- Iniziamo prendendo una WT e un mouse KO.
- Questi topi sono eutanasia da CO 2 inalazione e poi immersi nel 70% isopropranolol per 5 secondi. Questo passaggio impedisce la contaminazione delle cellule di interesse con il mouse e la pelliccia nelle nostre mani, non ha portato ad alcun compromesso della resa di cellule o risultati sperimentali.
- I topi sono poi sezionati a sua volta, usando un paio di pinze e forbici affilate. Di solito inizia con il mouse WT come una questione di routine. Un snip piccola è realizzata in pelle ventrale del mouse sovrastante l'addome e la pelle è poi allungato con le mani. La pelle si stacca con facilità gli arti posteriori. Il femore e la tibia vengono poi estratte facendo attenzione a non spostare la testa del femore come questa contiene una grande quantità di midollo osseo. Gli arti superiori sono staccata dal busto dell'animale semplicemente applicando una trazione a loro, mantenendo il busto immobile. Ciò elimina gli arti superiori come un pezzo. Gli omeri vengono poi estratti dalle arti superiori.
- Le ossa rimosse sono posti in PBS modificato che è stato aggiunto a 6 piastre. Modificato PBS è fatta con l'aggiunta di 2 ml di calore inattivato siero fetale bovino e 2 cc di EDTA 0,5 M pH8. Questa soluzione viene poi filtrata attraverso un 0,45 Nalgene uM filtro e può essere conservato a 4 ° C per almeno un mese.
- E 'essenziale per etichettare i pozzi nella piastra in modo da essere in grado di identificare WT e ossa KO correttamente.
- Le carcasse di topo sono stati rimossi e smaltiti.
- Un nuovo foglio si trova nel cofano e le ossa sono puliti con un bisturi monouso.
- Le ossa pulite sono posti un mouse in un momento nel mortaio. Due ml di PBS modificato viene aggiunta alla malta e le ossa sono schiacciati con un pestello. E 'importante primo frammento delle ossa con 10 movimenti avanti e indietro del pestello e poi polverizzare con movimenti rotatori circolari. Di solito lo faccio 50 in senso orario, poi 50 movimenti in senso antiorario e così via fino a quando il materiale lasciato nel mortaio è di colore bianco e la PBS modificato aggiunti al materiale rimane bianca o trasparente.
- Dopo ogni serie di 50 movimenti circolari frantumazione, abbiamo trasferire il liquido dalla malta per il 70 uM filtro collocato su un tubo da 50 ml. Non dimenticate di aggiungere 2 ml di PBS alla malta dopo ogni trasferimento il filtro. Non si vuole cercare di polverizzare ossa secche o lasciarli a secco per un certo periodo di tempo come questo porterà ad apoptosi delle cellule.
- Una volta che il materiale nel mortaio diventa bianco, il materiale nel filtro viene trasferita la malta e la frantumazione è di nuovo eseguita. Questo assicura che le cellule del filtro non sono sprecati. Di solito ci vogliono uno o due serie di movimenti rotatori circolari per rendere di nuovo il materiale in bianco malta di colore in quel momento l'estrazione delle cellule è completa.
- La soluzione nel tubo conico è ora centrifugato (ricordatevi di conservare le cellule dal WT e KO mouse separato. Quindi si avranno due tubi diversi (uno con celle di WT, l'altro con cellule KO). Centrifugare a 1200 rpm per 10 minuti.
- Aspirare il sopranatante con pipette aspirazione separate per ogni provetta. Aggiungere 2 cc di tampone di lisi ACK ad ogni pellet. Questo tampone di lisi devono essere sterili. Incubare in ghiaccio per 5 minuti.
- Aggiungere 8 cc di PBS modificato ad ogni provetta. Prendete 10 ul da ciascuna provetta e pipettare in due pozzetti separati in una piastra da 96 pozzetti. Collocare le provette nella centrifuga e spin loro a 1200 rpm per 10 minuti.
- Mentre i tubi girano, aggiungere 30 ul di tryphan colorante blu e 60 ul di PBS modificato in ciascun pozzetto della piastra 96 pozzetti che porta le cellule di interesse.
- Aggiungere 10 ul di questa miscela (si prega di mescolare bene pipettando su e giù) ad un emocitometro e contare le cellule nelle quattro piazze esterne.
- La conta delle cellule in ogni campione per ml è il numero di cellule contate così diviso per 4 e multiplied di 100 000.
- Una volta che la centrifugazione, rimuovere i tubi dalla centrifuga e risospendere le cellule in PBS senza calcio, magnesio o glutammina L ad una concentrazione di 20 milioni di cellule per ml. Molto probabilmente non avrete circa 5 ml di volume per il WT e 5 ml di volume per l'animale KO. Da questo punto in poi useremo PBS, non modificato PBS per il protocollo.
- Per ogni tubo aggiungere Dii, un colorante colorazione delle cellule, per ottenere una concentrazione finale di 5um. Agitare immediatamente al Vortex per 10 secondi. Incubare a 37 gradi per 10 minuti ed evitare l'esposizione alla luce.
- Riempire i tubi con PBS e girare per 10 minuti a 1200 giri al minuto.
- Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e risospendere le cellule in PBS a 40 milioni di cellule per ml.
- Carico 500 ul in siringhe da 1 cc con un ago 27G (5 siringhe per il mouse WT e 5 siringhe per i topi KO). Può essere prudente per preparare 6 siringhe per ogni coorte. Avendo in più si può aiutare le iniezioni vena della coda, che ci accingiamo a fare dopo può essere difficile.
- Coprire le siringhe con un foglio in modo da mantenere il DII di disintegrazione.
- Iniettare 500 ul della miscela in ogni cellula animale destinatario; (5 per ogni coorte).
- Questi animali devono essere irradiati con 9 Gy di irradiazione 4-24 ore prima dell'iniezione.
- 48 ore dopo l'iniezione, midollo osseo raccolta dal arti posteriori di ogni animale destinatario.
- Processo come descritto sopra per i donatori. Risospendere le cellule di ogni animale in 1 cc di PBS. Ottenere una conta delle cellule utilizzando un emocitometro.
- Leggere sul citometro a flusso LSR II da BD o un atto equivalente. Il risultato può essere espresso come numero assoluto o percentuale di cellule nel midollo osseo analizzato quali sono DII positivi.
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Discussion
Homing è il processo attraverso il quale le cellule del midollo osseo comprese le cellule staminali, le cellule staminali e differenziate, la loro strada nel midollo osseo dopo essere stata iniettata nel flusso del sangue o del midollo osseo di topi cavità. Come è evidente dalla definizione, uno scienziato può scegliere di studiare l'homing delle cellule staminali ematopoietiche, cellule progenitrici o cellule differenziate da immunofenotipizzazione identificato e isolato dalla separazione delle cellule. Di solito gli scienziati iniettare cellule del midollo osseo impoverito per i marcatori lignaggio e, quindi, arricchito per progenitrici e cellule staminali.
La dose di cellule iniettate di interesse è una variabile in questo esperimento. Il numero di celle può variare da 500 000 euro per il mouse destinatario a 20 milioni di euro del mouse destinatario. Le cellule più si può iniettare più facile la rilevazione nel midollo osseo. Numero disponibilità di cellule possono limitare il numero iniettato. Ordinamento 20 milioni LKS cellule SLAM è estremamente difficile, forse anche poco pratico con le tecnologie attuali maggior parte delle impostazioni di laboratorio, nel qual caso si potrebbe decidere di utilizzare un certo numero di cellule verso la parte bassa del range di cui sopra.
L'animale tubo in cui homing è in fase di studio può anche essere variata. Questo animale destinatario può essere un topo WT C57BL/6J che è stata letale irradiati con 9 Grays di radiazione come abbiamo fatto in questo esperimento, un mouse o una WT C57BL/6J W / Wv topo che non è stato irradiato. Se il mouse è irradiato o meno dipende dalla domanda lo sperimentatore sta cercando di rispondere. Se si è interessati a studiare homing in un ambiente dove una grande quantità di citochine è stato rilasciato e perdita vascolare viene indotto, un topo irradiato WT è una scelta appropriata. Un numero minore di cellule (500 000) può essere iniettato in un topo WT che non è stato irradiato in modo che le cellule staminali possono sede di un piccolo numero di nicchie libere senza l'fattori di confondimento di cui sopra.
W / Wv topi sono carenti di c-KIT funzione del recettore e può innestare le cellule staminali senza alcun condizionamento. Questo ci permette di studiare l'homing delle cellule staminali in assenza di lesioni vascolari o il rilascio di citochine causate da radiazioni. Il problema logistico con l'uso di questi topi è che è difficile ottenere un numero sufficiente di topi WWV per servire come destinatari a causa delle preoccupazioni colonia di riproduzione dimensioni.
In breve, anche se ci descrivono un protocollo standard di homing, le variazioni utilizzate dipendono dalla domanda a cui rispondere e deve essere determinata durante la progettazione dell'esperimento.
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Acknowledgments
Questo protocollo è stato testato e ottimizzato nel laboratorio del Dr. David Scadden. Il finanziamento è fornito dal Dana Farber Cancer Institute / Massachusetts General Hospital di Ematologia e Oncologia Clinica Fellowship Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Mediatech, Inc. | 21-031-CV | |
| Sterile Fetal Bovine Serum | Valley Biomedical, Inc. | BS3033 | |
| 0.5M EDTA (pH 8.0) | Boston BioProducts | BM-150 | |
| Tryphan Blue solution | Mediatech, Inc. | 25-900-CI | |
| ACK Lysing Buffer | Lonza Inc. | 10-548E | |
| Isopropranolol U.S.P. | Denison Pharmaceuticals, Inc | ||
| Vybrant DiD cell-labelling solution | Invitrogen | V22887 | |
| Vybrant DiI cell-labelling solution | Invitrogen | V22885 |
References
- Adams, G. B., et al. Stem cell engraftment at the endosteal niche is specified by the calcium-sensing receptor. Nature. 439 (7076), 599-603 (2006).
- Broxmeyer, H. E. Chemokines in hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 15 (1), 49-58 (2008).
