Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis

Summary

Ici nous démontrons micro-injection cytoplasmique de la

Abstract

Microinjection d'ovocytes de Xenopus laevis suivie mince sectionnement microscopie électronique (EM) est un excellent système pour étudier le transport nucléocytoplasmique. En raison de son gros noyau et une forte densité de complexes des pores nucléaires (NPC), transport de matières nucléaires peuvent être facilement visualisés dans l'ovocyte de Xénope. Beaucoup de perspicacité dans les mécanismes de l'importation et l'exportation nucléaire a été acquise grâce à l'utilisation de ce système (revu par Pantè, 2006). En outre, nous avons utilisé la microinjection d'ovocytes de Xenopus pour disséquer les voies import nucléaire de plusieurs virus qui se répliquent dans le noyau hôte.

Ici nous démontrer la micro-injection cytoplasmique des ovocytes de Xenopus avec un substrat import nucléaire. Nous montrons aussi la préparation des ovocytes injectés pour la visualisation par de minces coupes-EM, y compris la dissection, la déshydratation, et l'inclusion des ovocytes dans une résine époxy intégration. Enfin, nous fournissons des résultats représentatifs pour les ovocytes qui ont été micro-injecté avec la capside du nucléopolyhédrovirus baculovirus Autographa californica (AcMNPV) ou le virus minute parvovirus de la souris (MVM), et de discuter des applications potentielles de cette technique.

Protocol

Partie 1: Préparation des ovocytes de Xenopus pour la microinjection

1. Placer un petit morceau (environ 2 cm) de Xenopus laevis ovaire dans un tube conique de 50 ml contenant 20 ml de solution de collagénase (5 mg / ml de collagénase en calcium sans modification Barth salin: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mm MgSO _4, 10 mM Hepes, pH 7,5). La collagénase est utilisée pour enlever les cellules folliculaires qui entourent l'ovocyte.
2. Placer le tube sur une plateforme shaker et le rock en douceur (à 100 RPM) pendant une heure. Cette fois-ci varie en fonction de différents lots de la collagénase. Ainsi, après une heure, prendre un petit échantillon d'ovocytes et de les examiner sous un microscope à dissection. Correctement de-folliculated ovocytes doivent être bien séparés les uns des autres, et il devrait être facile à insérer une aiguille de verre dans l'ovocyte. Si les ovocytes ne sont pas suffisamment dé-folliculated, ils sont laissés dans la solution de collagénase et vérifié à nouveau toutes les cinq minutes.
3. Lavez les ovocytes à trois reprises avec une solution saline modifiés Barth (MBS: 88 mM de NaCl, 1 mM de KCl, 0,82 mM MgSO _4, 0,33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0,41 _mM de CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,5), et de les transférer un plat de 100 mm de diamètre de Petri contenant MBS majoré de 1% de pénicilline / streptomycine. Les ovocytes sont maintenant prêtes à être microinjectés. Si la micro-injection sera effectuée sur un autre jour, de stocker les ovocytes à 4 ° C jusqu'à une semaine.
4. En utilisant un microscope à dissection, sélectionnez matures ovocytes stade VI pour la microinjection. Ces ovocytes sont grandes, avec un bon contraste entre l'hémisphère animal noir et de l'hémisphère de couleur crème végétale.
5. Transférer les ovocytes matures stade VI dans une plaque de microtitration (Nunc, volume 10 ul bien). Cela devrait être fait avec soin, en utilisant une pipette de 200 pl avec une pointe de pipette qui a été coupé à la fin pour permettre d'aspiration sans perturbation des ovocytes.

Partie 2: microinjection d'ovocytes de Xenopus

1. Préparer le substrat d'importation soit microinjectés en ajoutant une petite quantité de bleu de bromophénol à 1%, pour aider à la visualisation de la micro-injection. Par exemple, nous ajoutons 1 pl de bleu de bromophénol à 10 ul de substrat.
2. Placer une petite bande de Parafilm sur un plat de 100 mm de diamètre de Petri, et dispenser une baisse de 5 pl de la solution à injecter sur la bande de Parafilm.
3. Remplir une aiguille d'injection préalablement étalonné (obtenu en tirant un 6,6-ul micropipette Drummond avec la Injecter + Matic Puller) avec la solution à injecter. Pour cela, le microinjecteur est réglé sur le mode d'aspiration. Pour calibrer l'aiguille d'injection faire des marques de points sur l'aiguille tous les 0,5 mm, ce qui correspond à un volume de 50 nl.
4. Pour l'injection cytoplasmique, insérez la pointe de l'aiguille dans un ovocyte dans l'hémisphère végétatif, très proche de l'hémisphère animal, à un angle d'environ 45 degrés. Tournez le réglage microinjecteur d'microinject et microinject chaque ovocyte avec 50 nl du substrat à l'importation. Les marques de point sur l'aiguille sont utilisés pour contrôler la quantité de substrat qui a été injecté.
5. Transfert des ovocytes injectés à un petit (35 mm de diamètre) boîte de Pétri remplie de MBS, et incuber à température ambiante pour la quantité désirée de temps (le temps des points sont choisis de manière à permettre l'observation du substrat à l'importation associés avec les PNJ, ce qui se produit entre 10 et 30 minutes pour les protéines et les virus qui sont activement transportés vers les PNJ, ce temps dépend aussi sur le site d'injection et de la taille de la protéine / virus).
6. Lorsque l'incubation est terminée, le transfert d'ovocytes dans un flacon en verre de 4 ml contenant du glutaraldéhyde à 2% en MBS, et de fixer une nuit à 4 ° C.

Partie 3: Dissection d'ovocytes de Xenopus

1. Le lendemain, lavez les ovocytes 3 fois avec MBS.
2. Transfert des ovocytes à une petite boîte de Petri remplie avec le tampon de faible teneur en sel (LSB: 1 mM de KCl, 0,5 mM _MgCl2, 10 mM d'HEPES, pH 7,5). En utilisant un microscope à dissection et la dissection des pinces à épiler, retirez le pôle végétal de chaque ovocyte. Il est utile pour stabiliser l'ovocyte étant disséqués avec une paire de pincettes, tandis que l'autre paire est utilisée comme des ciseaux pour enlever le pôle végétal. A ce stade, il est possible d'évaluer le succès de la micro-injection par la présence d'une teinte bleue dans le cytosol. Le protocole est poursuivi uniquement pour les ovocytes qui ont été microinjectés succès. En outre, si les échantillons doivent être préparés pour EM, cette étape de dissection, il est beaucoup plus facile de trouver le noyau lors de la coupe et la coupe des échantillons.
3. Fixer les ovocytes disséqués à nouveau avec du glutaraldéhyde à 2% en LSB pendant une heure à température ambiante.
4. Après fixation, laver les ovocytes disséqués à trois reprises avec LSB.

Partie 4: Préparation des ovocytes injectés pour l'intégration et EM-mince de sectionnement

1. Transfert des ovocytes disséqués sur une lame de dépression. Aspirer le plus de liquide que possiblesible, puis rapidement (afin qu'elles ne se dessèchent pas) couvrir les ovocytes disséqués avec 2% d'agarose à faible point de fusion. Alors que l'agarose est encore molle, utilisez une pointe de pipette pour séparer les uns des autres ovocytes, et de s'assurer que chaque ovocyte est face vers le haut ou vers le bas (pas de côté).
2. Laisser l'agarose à solidifier pendant environ 10 minutes. Une fois que l'agarose se solidifie, utiliser une lame de rasoir pour couper l'agarose en petits morceaux, chacun contenant un ovocyte disséqués.
3. Placez les ovocytes d'agarose-incorporé dans un flacon en verre de 4 ml, et les après-fixer avec 1% OsO ₄ en LSB pendant une heure à température ambiante.
4. Laver l'échantillon à trois reprises en LSB. Si nécessaire, conserver l'échantillon à 4 ° C la nuit et continuer le protocole le jour suivant.
5. Séquentiellement déshydrater les échantillons dans une série ascendante de l'alcool (50, 70 et 90% d'éthanol pour 20 minutes chacun). Il est suivi par deux changements dans l'éthanol à 100% pendant 15 min chacune. Enfin déshydrater les échantillons avec de l'acétone à 100% pendant 15 min.
6. Infiltrez les échantillons avec un mélange 1:1 d'Epon (Fluka) et l'acétone pendant une heure, suivie d'une infiltration avec un mélange 2:1 d'Epon et de l'acétone pendant deux heures, et enfin dans le plus pur Epon pendant au moins six heures.
7. Placer les échantillons dans des moules plats intégrant rempli de frais et pur Epon. Les ovocytes sont orientés de telle façon que le côté du noyau plus proche du site d'injection - dans ce cas le côté de l'ovocyte qui a été disséqué - sera sectionné en premier. Cette étape permet d'optimiser les chances de visualiser l'importation du substrat choisi.
8. Enfin, la polymérisation de la Epon pendant deux jours à 60 ° C.
9. Afin de visualiser les échantillons, les blocs sont taillés, puis sectionnés à l'aide un ultramicrotome. Les articles sont transférés sur des grilles EM, teinté en utilisant la procédure standard, et visualisées avec un microscope électronique à transmission. Nous n'allons pas montrer cette partie du protocole car elle est la procédure standard EM.

Partie 5: Résultats du représentant:

Si le protocole a été un succès, puis l'enveloppe nucléaire (NE) et les PNJ doivent être clairement visibles dans EM micrographies. Selon le injecté substrat et la quantité de temps entre l'injection et la fixation, le substrat doit être visible à la face cytoplasmique de l'APN, dans le PNJ, ou sur le front nucléaire de l'APN.

La figure 1 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d'un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides de l'AcMNPV de baculovirus, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour l'intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Un accueil capside à la face cytoplasmique d'un PNJ est indiquée par une flèche blanche.

En revanche, la figure 2 montre une coupe transversale NE à cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d'un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l'intégration et de section mince EM tel que décrit. En utilisant cette technique, nous avons constaté que MVM induit des perturbations de la NE (Cohen et Pantè, 2005). Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches.

Figure 1: Micrographie électronique d'un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d'un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec des capsides du baculovirus Ac MNPV, incubée à 4 ° C pendant quatre heures, et traitées pour enrobage et de lames minces EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Capsides sont indiquées par des flèches blanches. Barre d'échelle: 100 nm.

Figure 2: Micrographie électronique d'un NE section transversale cytoplasme adjacent (c) et le noyau (n) à partir d'un ovocyte de Xénope qui a été injecté avec le virus minute parvovirus de la souris (MVM), incubée à température ambiante pendant quatre heures, et traitées pour l'intégration et de section mince EM tel que décrit. Pointes de flèches point à des PNJ. Les parenthèses indiquent des ruptures dans le NE. Capsides MVM putatifs associés à la NE sont indiquées par des flèches blanches. Barre d'échelle: 100 nm.

Discussion

Microinjection d'ovocytes de Xenopus combinée avec de fines coupes-EM est un outil très efficace pour étudier le transport nucléocytoplasmique. Ce système a été utilisé pour cartographier les étapes distinctes de l'importation par le NPC, d'interaction exemple d'un substrat import nucléaire avec des composants structurels de l'APN, comme les filaments cytoplasmiques et nucléaires panier (revu par Pantè, 2006). Il a également été utilisée pour étudier l'import nucléaire de l'énergie nucléaire-réplication des virus (Pantè et Kann, 2002; Rabe et al, 2003;. Cohen et Pantè, 2005).

Une variante de la technique de micro-injection cytoplasmique montré ici est la microinjection nucléaire d'un substrat d'export nucléaire (Pantè et al., 1997). Pour effectuer l'injection nucléaire, les ovocytes sont placés dans une plaque de microtitration, orientée de sorte que les pôles des animaux face, et incubées à 4 ° C pendant la nuit. Le lendemain, les noyaux devraient être visibles comme une zone légèrement soulevée dans le pôle animal. Les noyaux sont microinjectés avec environ 25 nl du substrat d'exportation à une forte pente (plus de 45 degrés) l'angle et traitées pour l'intégration et EM mince coupe comme décrit ici.

Il est également important de noter que s'il s'agissait d'un substrat de transport qui n'est pas directement visible sous le microscope électronique, il est souvent nécessaire d'étiqueter le substrat avec une particule électron-opaques telles que l'or colloïdal (revu par Pantè, 2006).