Xenopus laevis Oosit, Mikroenjeksiyon

Summary

İşte biz sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir

Abstract

Ince kesit, elektron mikroskobu (EM) tarafından takip Xenopus laevis oositlerin Mikroenjeksiyon Nükleositoplazmik taşıma eğitimi için mükemmel bir sistem. Çünkü, büyük bir çekirdek ve yüksek yoğunluklu nükleer gözenek kompleksler (NPC), nükleer taşıma Xenopus oosit kolayca görüntülenebilmekte . Nükleer ithalat ve ihracat mekanizmalarına daha fazla fikir, bu sistemin kullanımı (Panté 2006) ile elde edilmiştir. Buna ek olarak, çeşitli virüslerin konak çekirdeğinde çoğaltmak nükleer ithalat yolları incelemek Xenopus oositler mikroenjeksiyon kullandık.

Burada bir nükleer ithalat substrat Xenopus oositlerin sitoplazmik mikroenjeksiyon göstermektedir. Ayrıca görünüm için enjekte oosit hazırlanması ince kesit diseksiyonu, dehidratasyon, ve oosit, epoksi gömme reçine içine yerleştirilmesi de dahil olmak üzere, EM. Son olarak, bakülovirüs Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) ya da Fare (MVM) parvovirus Dakika Virüs kapsid microinjected ve tekniğinin potansiyel uygulamaları tartışmak oosit temsilcisi sonuçlar sağlar .

Protocol

Bölüm 1: mikroenjeksiyon için Xenopus oosit hazırlanması

1. Xenopus laevis yumurtalık bir küçük parça (yaklaşık 2 cm) 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mm: kalsiyum-ücretsiz modifiye Barth Kullanıcı tuzlu su 20 ml kollajenaz çözüm (5 mg / ml kollajenaz içeren bir 50 ml konik tüp içine yerleştirin MgSO _4, 10 mM HEPES, pH 7.5). Kollajenaz oosit çevreleyen folikül hücreleri çıkarmak için kullanılır.
2. Çalkalayıcı platform üzerinde tüp yerleştirin ve bir saat (100 RPM) hafifçe sallayın. Bu sefer farklı birçok kollajenaz ile değişir. Böylece bir saat sonra oosit, küçük bir örnek alır ve onları incelemek diseksiyon mikroskobu altında. Düzgün de folliculated oosit birbirinden ayrılmış olmalı ve bu yumurtanın içine bir bardak iğne eklemek için kolay olmalıdır. Oosit yeterince de folliculated değilseniz, kollajenaz çözüm sol ve her beş dakikada bir tekrar kontrol edilir.
3. (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO _4, 0.33 mM Ca (NO _{3) 2,} 0.41 mM CaCl _2, 10 mM HEPES, pH 7.5) modifiye Barth en tuzlu oosit üç kez yıkayın, ve bunları aktarmak MBS artı% 1 penisilin / streptomisin içeren bir 100 mm çaplı Petri kabı. Oosit artık microinjected hazır. Mikroenjeksiyon başka bir gün yapılacak ise, bir hafta boyunca, 4 ° C'de oosit saklayın.
4. Diseksiyon mikroskop kullanarak, mikroenjeksiyon için olgun sahne VI oosit seçin. Bu oosit siyah hayvan yarımkürede arasında iyi bir kontrast ve krem ​​renkli bitkisel yarımkürede, büyük.
5. Bir kuyu plaka (Nunc, 10 ul iyi hacim) olgun aşamasında VI oosit aktarın. Bu oositlerin undisrupted emme izin sonunda kesilmiş bir pipet ucu ile 200-ul pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde yapılmalıdır.

Bölüm 2: Xenopus oositleri Mikroenjeksiyon

1. Mikroenjeksiyon görselleştirme yardımcı olmak için,% 1 bromphenol mavi küçük bir miktar ekleyerek microinjected ithalat substrat hazırlayın. Örneğin, substrat 10 ul bromphenol mavi 1 ul ekleyin.
2. 100 mm çaplı Petri kabı Parafilm küçük bir şerit yerleştirin ve Parafilm şerit enjekte edilecek çözümün bir 5-ul damla dağıtmak.
3. Enjekte edilebilir bir çözüm ile daha önce kalibre edilmiş bir enjeksiyon iğnesi (enjekte + Matic Çektirme 6.6-ul mikropipet Drummond çekerek edilen) doldurun. Bunun için, mikroenjektör aspirasyon modunda ayarlanır. 50 nl bir birime karşılık her 0.5 mm, enjeksiyon iğnesi kalibre etmek için iğne nokta işaretleri yapmak.
4. Sitoplazmik enjeksiyon için, yaklaşık 45 derecelik bir açıyla, hayvan yarımkürede çok yakın, bitkisel yarımkürede bir oosit içine iğne ucu takın. Microinject mikroenjektör ayarı açın ve ithalat substrat 50 nl her oosit microinject. Iğne nokta işaretleri enjekte edilmiştir substrat miktarını izlemek için kullanılır.
5. Enjekte edilen oosit MBS ile dolu bir küçük (35 mm çap) Petri kabı Transferi, ve zaman istenilen miktarda oda sıcaklığında inkübe NPC'ler ile ilişkili ithalat yüzey gözlem izin verecek şekilde (zaman noktaları seçilir; Bu durumda proteinler ve aktif NPC doğru taşınır virüsler için 10 ile 30 dakika arasında, bu sefer de) enjeksiyon yerinde ve protein / virüs boyutunu bağlıdır.
6. Inkübasyon tamamlandığında, MBS% 2 glutaraldehyde içeren 4 ml cam şişe oosit transferi, ve 4 gecede düzeltmek ° C

Bölüm 3: Xenopus oositleri Diseksiyon

1. Ertesi gün, MBS oosit 3 kere yıkayın.
2. Düşük tuz tamponu (: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl _2, 10 mM Hepes, pH 7.5 LSB) ile dolu küçük bir Petri kabı oosit aktarın. Diseksiyon mikroskobu kullanma ve cımbız diseksiyon her oosit bitkisel kutup çıkarın. Diğer çifti makas gibi bitkisel kutup kaldırmak için kullanılır, bir çift cımbız ile disseke oosit stabilize etmek için yararlıdır. Bu noktada sitoplazmada mavi bir belirti varlığı mikroenjeksiyon başarısını değerlendirmek mümkündür. Protokolü sadece başarıyla microinjected oosit devam etmektedir. Buna ek olarak, örnekleri, EM için hazırlıklı olmak, bu diseksiyon adım kırparak ve numunelerin kesit çekirdeğini bulmak için çok daha kolay hale getirir.
3. % 2 oda sıcaklığında bir saat LSB glutaraldehid disseke oosit tekrar sabitleyin.
4. Fiksasyon sonra, LSB disseke oosit üç defa yıkamak.

Bölüm 4: Injected Oosit gömme ve EM İnce-Kesit için hazırlanması

1. Disseke oosit bir depresyon slayt aktarın. Pos olarak sıvı aspire(bu yüzden kurumasına kalmamasıdır) sible ve sonra hızlı bir şekilde% 2 düşük erime agaroz ile disseke oosit kapsar. Agaroz hala yumuşak olmasına rağmen, oosit birbirinden ayırmak için bir pipet kullanın ve her oosit yüzü yukarı veya aşağı olduğunu sağlamak için (yanlara değil).
2. Agaroz yaklaşık 10 dakika katılaşmasını sağlayın. Agaroz katılaşır sonra, küçük parçalar halinde, her bir disseke oosit içeren içine agaroz kesmek için jilet kullanın.
3. Agaroz gömülü oosit 4 ml cam şişe yerleştirin ve oda sıcaklığında bir saat için% 1 LSB olarak ₄ OsO sonrası onları düzeltmek.
4. Örnek LSB üç kez yıkayın. Gerekirse, 4 ° C gecede numune saklamak ve ertesi gün devam protokol.
5. Sırayla (20 dakika her biri için 50, 70, ve% 90 etanol), alkol artan serisi örnekleri kurutmak. Bu, 15 dakika her biri için% 100 etanol iki değişiklikleri takip eder. Son 15 dakika için% 100 aseton ile örnekleri kurutmak.
6. ,, En az altı saat süreyle 2:1 iki saat EPON ve aseton karışımı ve sonunda saf EPON infiltrasyonu ile takip bir saat 01:01 EPON karışımı (Fluka) ve aseton, örnekleri Infiltrate.
7. Taze saf EPON düz gömme kalıplara yerleştirin örnekleri ile dolu. Oosit şekilde odaklı olduğunu enjeksiyon yakın çekirdeğin yan - Bu durumda disseke olmuştur oosit yan ilk kesitli olacak. Bu adım, seçilen substrat ithalat görselleştirme şansı en iyi hale getirir.
8. Son olarak, iki gün, 60 ° C için EPON polimerize
9. Örnekleri görselleştirmek için, blokları ultramicrotome kullanarak kesilmiş ve sonra kesitli vardır. Bölümler EM ızgaraları, standart prosedür kullanılarak boyandı aktarılır ve bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülendi. Standart EM prosedür olarak protokol bu bölümü görünmeyecektir.

Bölüm 5: Temsilcilik Sonuçları:

Protokolü başarılı olmuşsa, daha sonra nükleer zarf (NE) ve NPC'ler EM mikrograflar açıkça görünür olmalıdır. Substrat enjekte edilir ve enjeksiyon ve fiksasyon arasındaki zaman miktarına bağlı olarak, yüzey NPC, ya da nükleer yüzüne NPC NPC sitoplazmik yüzü görünür olmalıdır.

Şekil 1 bir kesit bakülovirüs AcMNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit dört saat 4 ° C'de inkübe komşu sitoplazma (c) ve nukleus (n), KD, ve gömme ve ince kesit için işlenmiş gösterir . EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC'ler noktası. Kapsid yerleştirme bir NPC sitoplazmik yüzü beyaz bir okla gösterilir.

Buna karşılık, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile kesit Şekil 2 KD gösterir ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Bu tekniği kullanarak, MVM KD (Cohen ve Panté, 2005) bozulmasına neden olur ki bulduk. Parantezler NE tatili göstermektedir. Arrowheads NPC'ler noktası. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir.

Şekil 1: Elektron mikrograf 4 inkübe bakülovirüs Ac MNPV capsids enjekte edilmiş bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ° C, dört saat için işlenmiş gömme ve ince kesit EM olarak nitelendirdi. Arrowheads NPC'ler noktası. Capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm.

Şekil 2: Elektron mikrografı, dört saat boyunca oda sıcaklığında inkübe Fare parvovirus Dakika Virüsü (MVM), enjekte edildiği bir Xenopus oosit (c) komşu sitoplazma ve çekirdek (n) ile KD kesit ve EM açıklandığı gibi gömme ve ince kesit için işlenmiş. Arrowheads NPC'ler noktası. Parantezler NE tatili göstermektedir. KD ile ilişkili olası MVM capsids beyaz oklarla gösterilir. Ölçek çubuğu: 100 nm.

Discussion

Mikroenjeksiyon ince kesit EM ile birlikte Xenopus oositleri Nükleositoplazmik taşıma çalışmak için son derece etkili bir araçtır . Bu sistem, sitoplazmik filamentler ve nükleer sepeti (Panté 2006) gibi NPC yapısal bileşenleri ile bir nükleer ithalat substrat örnek etkileşim için ithalat farklı adımlar, NPC ile eşleştirmek için kullanılır olmuştur. Aynı zamanda nükleer kopyalayan virüs nükleer ithalat (; Rabe ve ark, 2003; Cohen ve Panté, 2005 Panté ve Kann, 2002) çalışma için kullanılır olmuştur.

Burada gösterilen sitoplazmik mikroenjeksiyon tekniği bir varyasyon nükleer mikroenjeksiyon bir nükleer ihracat substrat (Panté ve ark, 1997). Nükleer enjeksiyon gerçekleştirmek için, oosit hayvan kutuplar kadar karşı karşıya kaldığı odaklı, bir kuyu plaka yerleştirilir ve 4 ° C gece boyunca inkübe. Ertesi gün, çekirdekleri hayvan kutup hafifçe yükseltilmiş bir alan olarak görünür olmalıdır. Çekirdekleri dik bir açıyla (daha büyük 45 derecelik bir), ihracat substrat yaklaşık 25 nl ile microinjected ve gömme ve burada açıklandığı gibi EM ince kesit işlenir.

Elektron mikroskop altında doğrudan görünmez bir ulaşım substrat ile uğraşırken, genellikle kolloidal altın (2006 Panté tarafından yorumlanan) gibi bir elektron-opak partikül yüzey etiketlemek için gerekli olduğunu da not etmek önemlidir.