Summary
כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic של
Abstract
Microinjection של ביציות Xenopus laevis ואחריו במיקרוסקופ אלקטרונים חתך דק (EM) היא מערכת מצוינת לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. בגלל גרעין גדול שלה צפיפות גבוהה של קומפלקסים נקבוביות הגרעין (NPCs), תחבורה גרעיני ניתן דמיינו בקלות הביצית Xenopus. תובנה הרבה לתוך המנגנונים של ייבוא, ייצוא גרעיני כבר צבר באמצעות השימוש במערכת זו (נבדקה על ידי Panté, 2006). בנוסף, השתמשנו microinjection של ביציות Xenopus לנתח את המסלולים לייבא גרעיני של וירוסים מספר לשכפל בגרעין המארח.
כאן אנו מדגימים את microinjection cytoplasmic של ביציות Xenopus עם מצע לייבא גרעיני. אנחנו גם מראים הכנה של ביציות מוזרק להדמיה על ידי חתך דק EM, כולל לנתיחה, התייבשות, והטבעה של ביציות לתוך שרף אפוקסי הטבעה. לבסוף, אנו מספקים תוצאות נציג עבור ביציות, כי כבר microinjected עם capsid של nucleopolyhedrovirus baculovirus californica Autographa (AcMNPV) או דקה parvovirus וירוס של עכברים (MVM), ולדון יישומים פוטנציאליים של הטכניקה.
Protocol
חלק 1: הכנת ביציות Xenopus עבור microinjection
- מניחים חתיכה קטנה (כ 2 ס"מ) של השחלה laevis Xenopus לשפופרת 50 מ"ל חרוטי המכיל 20 מ"ל של תמיסת collagenase (5 מ"ג / מ"ל collagenase בסידן ללא מלח שונה של בארת: mm 0.82 88 mM NaCl, 1 mM KCl, MgSO 4, 10 Hepes מ"מ, pH 7.5). Collagenase משמש כדי להסיר את התאים זקיק אשר מקיפים את ביציות.
- מניחים את הצינור על מצע שייקר ורוק אותו בעדינות (בכל סל"ד 100) במשך שעה אחת. פעם זה משתנה עם המון שונים של collagenase. כך לאחר שעה אחת, לקחת דגימה קטנה של ביציות ולבחון אותם תחת מיקרוסקופ לנתח. כראוי דה folliculated ביציות צריכים להיות מופרדים היטב זה מזה, ועל זה צריך להיות קל להכניס מחט זכוכית לתוך הביצית. אם ביציות אינם מספיק דה folliculated, הם עזבו את הפתרון collagenase ובדק שוב כל חמש דקות.
- שטפו את ביציות שלוש פעמים (MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.82 mM MgSO 4, 0.33 mM Ca (NO 3) 2, 0.41 mM CaCl 2, 10 Hepes מ"מ, pH 7.5) מלוחים שונה של בארת', ולהעבירם אל צלחת בקוטר 100 מ"מ פטרי המכילות MBS פלוס 1% פניצילין / סטרפטומיצין. ביציות מוכנים כעת להיות microinjected. אם microinjection יבוצעו ביום אחר, בחנות ביציות על 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
- באמצעות מיקרוסקופ לנתח, בחר בוגרת השישי בשלב ביציות עבור microinjection. ביציות אלה הם גדולים, עם ניגודיות טובה בין האונה חיה שחורה האונה בצבע שמנת צמחית.
- העברת VI ביציות בוגרות שלב לתוך צלחת microwell (Nunc, 10 נפח היטב μl). זה צריך להיעשות בזהירות, תוך שימוש pipettor 200 μl עם קצה פיפטה כי נחתך בסוף כדי לאפשר שאיבה של ביציות undisrupted.
חלק 2: Microinjection של ביציות Xenopus
- הכינו את המצע לייבא להיות microinjected ידי הוספת כמות קטנה של כחול bromphenol 1%, כדי לסייע להדמיה של microinjection. לדוגמה, נוסיף 1 μl של כחול bromphenol עד 10 μl של המצע.
- מניחים רצועה קטנה של Parafilm על צלחת בקוטר 100 מ"מ פטרי, לוותר על ירידה של 5 μl של הפתרון להיות מוזרק על רצועת Parafilm.
- מלא מחט הזריקה מכויל בעבר (מתקבל על ידי משיכת 6.6-μl micropipette דראמונד עם הזרק + פולר Matic) עם פתרון להיות מוזרק. לשם כך, microinjector מוגדר על מצב השאיפה. כדי לכייל את מחט הזריקה לעשות מסמן נקודה על המחט כל 0.5 מ"מ, אשר מתאימות בהיקף של 50 nl.
- עבור זריקה cytoplasmic, הכנס את קצה המחט לתוך הביצית בחצי הכדור צמחיים, קרוב מאוד בחצי הכדור החי, בזווית של כ 45 מעלות. הפעל את ההגדרה microinjector כדי microinject ו microinject כל הביצית עם 50 nl של המצע לייבא. מסמן נקודה על המחט משמשים כדי לפקח על כמות המצע כי כבר הזריק.
- מעבירים את ביציות מוזרק אל צלחת פטרי קטנה (35 מ"מ קוטר) מלא MBS, ועל דגירה בטמפרטורת החדר למשך פרק הזמן הרצוי (נקודות זמן נבחרים כדי לאפשר תצפית של המצע לייבא הקשורים NPCs, זה קורה בין 10 ל 30 דקות חלבונים עבור וירוסים מועברים באופן פעיל לכיוון ה NPC, הפעם גם תלוי במקום ההזרקה ואת גודל של החלבון / וירוס).
- כאשר הדגירה תושלם, העברת ביציות כדי בקבוקון 4 מ"ל כוס המכילה glutaraldehyde 2% MBS, ולתקן לילה בשעה 4 ° C.
חלק 3: Dissection של ביציות Xenopus
- למחרת, לשטוף את ביציות 3 פעמים עם MBS.
- העברת ביציות כדי בצלחת פטרי קטן מלא חיץ מלח נמוכה (LSB: 1 mM KCl, 0.5 mM MgCl 2, 10 HEPES מ"מ, pH 7.5). באמצעות מיקרוסקופ הניתוח, לנתח פינצטה, להסיר את מוט הצמחי מן הביצית כל אחד. זה שימושי כדי לייצב את הביצית להיות גזור עם זוג אחד פינצטה, בעוד זוג אחר משמש כמו מספריים כדי להסיר את מוט צמחיים. בשלב זה ניתן להעריך את ההצלחה של microinjection על ידי נוכחות של גוון כחול cytosol. הפרוטוקול הוא נמשך רק עבור ביציות שהיו microinjected בהצלחה. בנוסף, אם הדגימות הן להיות מוכן EM, שלב זה לנתיחה עושה את זה הרבה יותר קל למצוא את הגרעין כאשר זמירה ואת חתך את הדגימות.
- תקן את ביציות גזור שוב עם glutaraldehyde 2% LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לאחר קיבוע, לשטוף את ביציות גזור שלוש פעמים עם LSB.
חלק 4: הכנת הזריקה ביציות עבור Embedding ו-Thin חתך EM
- מעבירים את ביציות גזור לשקופית דיכאון. לשאוב כמה שיותר נוזלים כמו possible, ולאחר מכן במהירות (כך שהם לא לייבש) לכסות את ביציות גזור עם 2% נמוך ההיתוך agarose. בעוד agarose עדיין רך, להשתמש קצה פיפטה להפריד בין ביציות אחד מהשני, ועל מנת להבטיח כי כל הביצית היא עם הפנים כלפי מעלה או כלפי מטה (לא לצדדים).
- אפשר agarose כדי לחזק למשך כ -10 דקות. לאחר agarose מבצרת, השתמש סכין גילוח לחתוך את agarose לחתיכות קטנות, כל אחד המכיל ביצית גזור.
- מניחים את agarose-ביציות מוטבע בבקבוקון 4-ml זכוכית, שלאחר לתקן אותם עם 1% OSO 4 ב LSB שעה אחת בטמפרטורת החדר.
- לשטוף את המדגם שלוש פעמים LSB. במידת הצורך, החנות מדגם ב 4 ° C במשך הלילה ולהמשיך את הפרוטוקול למחרת.
- ברצף מייבשים את דגימות בסדרה עולה של אלכוהול (50, 70, ו 90% אתנול עבור 20 דקות כל אחד). זה ואחריו שני שינויים אתנול 100% במשך 15 דקות כל אחד. לבסוף מייבשים דגימות עם אצטון 100% במשך 15 דקות.
- חדור דגימות בתערובת 01:01 של EPON (Fluka) ו אצטון למשך שעה אחת, ואחריה חדירה בתערובת 02:01 של EPON ו - אצטון במשך שעתיים, ולבסוף טהור EPON לפחות שש שעות.
- דגימות מקום תבניות הטבעה שטוח מלאים טריים טהור EPON. ביציות מכוונים בצורה כזאת שהצד של גרעין קרוב הזריקה - במקרה הזה את הצד של ביציות כי כבר גזור - יהיה מחולק הראשון. צעד זה מייעל את הסיכוי חזותי הייבוא של המצע הנבחר.
- לבסוף, לפלמר EPON יומיים בבית 60 ° C.
- על מנת להמחיש את הדוגמאות, בלוקים הם גזוז מחולק מכן באמצעות ultramicrotome. מדורים מועברים על גבי רשתות EM, מוכתמים באמצעות הליך רגיל, ועל דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. אנחנו לא יראה את החלק הזה של הפרוטוקול כפי שהוא הליך סטנדרטי EM.
חלק 5: תוצאות נציג:
אם הפרוטוקול היה מוצלח, אז מעטפת הגרעין (NE) ו NPCs צריך להיות נראית בבירור EM micrographs. בהתאם הזריק את המצע ואת משך הזמן בין הזרקה קיבעון, המצע צריך להיות גלוי בפניו cytoplasmic של NPC, על NPC, או על הפנים הגרעינית של NPC.
איור 1 מציג NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus AcMNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ומעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. עגינה capsid בפניו cytoplasmic של NPC מצוין על ידי חץ לבן.
לעומת זאת, איור 2 מראה NE חתך עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. באמצעות טכניקה זו, מצאנו כי MVM גורם לשיבושים של NE (כהן Panté, 2005). בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים.
איור 1: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרקו capsids של baculovirus Ac MNPV, מודגרות ב 4 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות, ועובדו הטבעה וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. Capsids מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר.
איור 2: מיקרוסקופ אלקטרונים של חתך-NE עם הציטופלסמה הסמוכה (ג) ו - גרעין (n) של הביצית Xenopus כי כבר הוזרק וירוס parvovirus דקה של עכברים (MVM), מודגרות בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות, מעובד להטבעת וסעיף דק EM כמתואר. ראשי חץ הצבע על NPCs. בסוגריים מצביעים על הפסקות NE. Capsids MVM המשוערת הקשורים NE מסומנים על ידי חצים לבנים. בר קנה מידה: 100 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Microinjection של ביציות Xenopus בשילוב עם חתך דק EM הוא כלי יעיל לחקר התחבורה nucleocytoplasmic. מערכת זו נעשה שימוש כדי למפות שלבים ברורים של יבוא דרך NPC, עבור אינטראקציה דוגמה מצע לייבא גרעיני עם רכיבים מבניים של ה NPC כמו חוטים cytoplasmic וסל גרעיני (נבדקה על ידי Panté, 2006). הוא שימש גם כדי ללמוד את יבוא גרעיני של גרעיני שכפול וירוסים (Panté ו קאן, 2002; Rabe et al, 2003;. Panté כהן, 2005).
אחת וריאציה של הטכניקה microinjection cytoplasmic המוצג כאן הוא microinjection הגרעין של מצע יצוא גרעיני (Panté et al. 1997). כדי לבצע הזרקה גרעיני, ביציות ממוקמים צלחת microwell, אוריינטציה כך הקטבים חיה עם הפנים כלפי מעלה, וטופחו על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, גרעינים צריך להיות גלוי כאזור מוגבהת מעט מוט החי. הגרעינים הם microinjected עם כ 25 nl של המצע יצוא בזווית (יותר מ -45 מעלות) תלולה מעובד להטבעת ורזה-EM חתך כפי שמתואר כאן.
חשוב גם לציין כי בעת התמודדות עם מצע תחבורה שאינו גלוי ישירות מתחת למיקרוסקופ אלקטרונים, היא לעתים קרובות צורך התווית המצע עם חלקיק אלקטרון אטום כגון זהב colloidal (נבדקה על ידי Panté, 2006).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים דוד Theilmann (פסיפיק Agri-Food Research Centre, Summerland, קולומביה הבריטית) למתן AcMNPV baculovirus ו לדיון מועיל.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן קנדה עבור חדשנות (CFI), המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR), מייקל סמית הקרן לבריאות מחקר (MSFHR), ואת למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) .
References
- Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
- Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13 (2), 425-434 (2002).
- Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (17), 9849-9854 (2003).
- Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86 (12), 3243-3252 (2005).
- Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
