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Biology

Xenopus Laevis oocytes के Microinjection

doi: 10.3791/1106 Published: February 23, 2009

Summary

यहाँ हम cytoplasmic microinjection का प्रदर्शन

Abstract

Xenopus laevis oocytes के Microinjection पतली सेक्शनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM) द्वारा पीछा nucleocytoplasmic परिवहन अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम है. अपने बड़े नाभिक और परमाणु ताकना परिसरों (NPCs) के उच्च घनत्व के कारण, परमाणु परिवहन Xenopus oocyte में आसानी से देखे जा सकते हैं. परमाणु आयात और निर्यात के तंत्र में ज्यादातर अंतर्दृष्टि इस प्रणाली का उपयोग (Panté, 2006 द्वारा की समीक्षा की) के माध्यम से प्राप्त की है. इसके अलावा, हम Xenopus oocytes के microinjection का इस्तेमाल किया है कई वायरस के परमाणु आयात मार्ग है कि मेजबान नाभिक में दोहराने को काटना .

यहाँ हम एक परमाणु आयात सब्सट्रेट के साथ Xenopus oocytes की cytoplasmic microinjection प्रदर्शित करता है . हम भी दृश्य के लिए इंजेक्शन oocytes की तैयारी दिखाने पतली सेक्शनिंग EM विच्छेदन, निर्जलीकरण, और एक epoxy एम्बेडिंग राल में oocytes की एम्बेड सहित,. अंत में, हम oocytes कि microinjected baculovirus Autographa californica (AcMNPV) nucleopolyhedrovirus या चूहे (MVM) parvovirus मिनट वायरस के capsid के साथ किया गया है, और तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा के लिए प्रतिनिधि परिणाम प्रदान करते हैं.

Protocol

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भाग 1: Xenopus oocytes के microinjection के लिए तैयार

  1. 88 मिमी NaCl, 1 मिमी KCl, 0.82 मिमी: एक 50 - मिलीलीटर शंक्वाकार कैल्शियम - मुक्त संशोधित है बार्थ खारा में collagenase (समाधान 5 collagenase मिलीग्राम / एमएल के 20 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में Xenopus laevis अंडाशय के एक छोटे टुकड़े (लगभग 2 सेमी) रखें MgSO 4, 10 मिमी Hepes, पीएच 7.5). Collagenase के लिए कूप कोशिकाओं जो oocytes घेर को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है.
  2. एक प्रकार के बरतन मंच पर ट्यूब प्लेस और यह धीरे एक घंटे के लिए रॉक (100 आरपीएम पर). इस बार collagenase के विभिन्न बहुत साथ बदलता रहता है. इस प्रकार एक घंटे के बाद, oocytes की एक छोटा सा नमूना ले और उन्हें एक विदारक खुर्दबीन के नीचे की जांच. ठीक से डी - folliculated oocytes अच्छी तरह से एक दूसरे से अलग किया जाना चाहिए, और यह आसान हो oocyte में एक गिलास सुई डालने चाहिए. यदि oocytes पर्याप्त de-folliculated नहीं कर रहे हैं, वे collagenase समाधान में छोड़ दिया जाता है और फिर हर पांच मिनट की जाँच की.
  3. Oocytes संशोधित बार्थ खारा (एमबीएस: 88 मिमी NaCl, 1 मिमी KCl, .82 मिमी MgSO 4, 0.33 मिमी (3 सं) Ca 2, 0.41 मिमी 2 CaCl, 10 मिमी Hepes, 7.5 पीएच) के साथ तीन बार धो, और उन्हें हस्तांतरण एक व्यास 100 मिमी एमबीएस से अधिक 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पेट्री डिश. oocytes अब कर रहे हैं microinjected बनने के लिए तैयार है. यदि microinjection एक और दिन पर प्रदर्शन किया जाएगा, 4 ° C में एक सप्ताह तक के लिए oocytes की दुकान.
  4. एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, microinjection के लिए परिपक्व चरण छठी oocytes का चयन करें. ये oocytes बड़े काले जानवर गोलार्द्ध और मलाईदार रंग वनस्पति गोलार्द्ध के बीच अच्छे विपरीत के साथ कर रहे हैं.
  5. एक microwell प्लेट (Nunc, 10 μl अच्छी तरह मात्रा) में परिपक्व चरण छठी oocytes स्थानांतरण. यह सावधानी से किया जाना चाहिए, एक विंदुक टिप है कि अंत में कटौती की गई है oocytes की undisrupted चूषण की अनुमति के साथ एक 200-μl pipettor का उपयोग.

भाग 2: Xenopus oocytes के Microinjection

  1. आयात सब्सट्रेट तैयार करने के लिए 1% bromphenol नीले रंग की एक छोटी राशि जोड़ने microinjection के दृश्य में सहायता द्वारा microinjected हो. उदाहरण के लिए, हम सब्सट्रेट के 10 μl bromphenol नीले रंग का 1 μl जोड़ें.
  2. 100 मिमी की एक व्यास पेट्री डिश पर एक Parafilm की छोटी पट्टी प्लेस, और 5 μl Parafilm पट्टी पर इंजेक्शन जा समाधान की एक बूंद के बग़ैर.
  3. इंजेक्शन जा समाधान के साथ एक पहले से calibrated इंजेक्शन सुई (सुई + राजनयिक डांड़ी के साथ एक 6.6 μl micropipette Drummond खींच कर प्राप्त) भरें. इस के लिए, microinjector आकांक्षा मोड पर सेट कर दिया जाता है. इंजेक्शन सुई जांचना सुई पर बिंदी के निशान हर 0.5 मिमी है, जो 50 nl की एक मात्रा के अनुरूप बनाते हैं.
  4. Cytoplasmic इंजेक्शन के लिए, एक oocyte में वनस्पति गोलार्द्ध में सुई की नोक, डालने के बहुत जानवर गोलार्द्ध के करीब एक लगभग 45 डिग्री के कोण पर. मुड़ें microinjector सेटिंग microinject करने के लिए, और 50 nl आयात सब्सट्रेट के साथ प्रत्येक oocyte microinject. सुई पर डॉट के निशान को इंजेक्ट किया गया है कि सब्सट्रेट की राशि पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जाता है.
  5. एक छोटे से (35 मिमी व्यास) पेट्री एमबीएस के साथ भरा पकवान इंजेक्शन oocytes स्थानांतरण, और समय के वांछित राशि के लिए कमरे के तापमान पर सेते (समय अंक के रूप में आयात NPCs के साथ जुड़े सब्सट्रेट के अवलोकन की अनुमति देने के लिए चुना जाता है तो, यह तब होता है प्रोटीन के लिए और वायरस है कि सक्रिय रूप से एनपीसी की ओर ले जाया जाता है के लिए 10 और 30 के बीच मिनट, इस बार भी इंजेक्शन के स्थल और प्रोटीन / वायरस के आकार पर निर्भर करता है).
  6. जब ऊष्मायन पूरा हो गया है, एक गिलास 4 मिलीलीटर एमबीएस में 2% की glutaraldehyde युक्त शीशी oocytes हस्तांतरण, और 4 में रात भर ठीक डिग्री सेल्सियस

भाग 3: Xenopus oocytes के विच्छेदन

  1. अगले दिन, oocytes एमबीएस के साथ 3 बार धो लो.
  2. एक छोटे से पेट्री कम नमक बफर (: 1 मिमी KCl, 0.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी HEPES, 7.5 पीएच LSB) के साथ भरा पकवान oocytes स्थानांतरण . एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग और चिमटी विदारक प्रत्येक oocyte से वनस्पति पोल हटा दें. यह चिमटी की एक जोड़ी के साथ dissected किया जा रहा है oocyte स्थिर करने के लिए उपयोगी है, जबकि अन्य जोड़ी कैंची की तरह इस्तेमाल किया जाता है वनस्पति पोल हटाने है. इस बिंदु पर यह cytosol में एक नीले रंग की उपस्थिति द्वारा microinjection की सफलता का मूल्यांकन करने के लिए संभव है. प्रोटोकॉल oocytes कि सफलतापूर्वक microinjected किया गया के लिए ही जारी रखा है. इसके अलावा, अगर नमूने के EM के लिए तैयार हो रहे हैं, इस विच्छेदन कदम यह बहुत नाभिक जब trimming और नमूने सेक्शनिंग आसान बनाता है.
  3. LSB में कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए 2% glutaraldehyde के साथ dissected oocytes फिर ठीक है.
  4. निर्धारण के बाद, dissected oocytes LSB के साथ तीन बार धो लो.

भाग 4: इंजेक्शन oocytes एम्बेडिंग और EM पतला - सेक्शनिंग के लिए तैयार

  1. एक अवसाद स्लाइड dissected oocytes स्थानांतरण. के रूप में स्थिति के रूप में तरल पदार्थ की बहुत Aspirateअसंभव है, और फिर जल्दी (ताकि वे बाहर सूखी नहीं) के साथ 2% की कम पिघलने agarose dissected oocytes को कवर. जबकि agarose अभी भी नरम है, एक विंदुक टिप का उपयोग करने के लिए एक दूसरे से अलग oocytes, और सुनिश्चित करें कि प्रत्येक oocyte चेहरा है या नीचे (बग़ल में नहीं).
  2. Agarose के बारे में 10 मिनट के लिए जमना करने के लिए अनुमति दें. एक बार agarose solidifies, एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें agarose छोटे टुकड़े, प्रत्येक जिसमें एक विच्छेदित oocyte में कटौती.
  3. एक गिलास 4 मिलीलीटर की शीशी में agarose - एम्बेडेड oocytes प्लेस, और 1% Oso 4 में LSB के साथ उन्हें कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए पोस्ट - ठीक है.
  4. नमूना LSB में तीन बार धोएं. यदि आवश्यक हो, तो 4 में नमूना डिग्री सेल्सियस रातोंरात स्टोर और प्रोटोकॉल अगले दिन जारी है.
  5. क्रमिक रूप से (20 मिनट प्रत्येक के लिए 50, 70, और 90% इथेनॉल) शराब के एक आरोही श्रृंखला में नमूने निर्जलीकरण. यह 15 मिनट प्रत्येक के लिए दो 100% इथेनॉल में परिवर्तन के द्वारा पीछा किया जाता है. अंत में 15 मिनट के लिए 100% एसीटोन के साथ नमूने निर्जलीकरण.
  6. EPON की एक 1:1 मिश्रण (Fluka) और एसीटोन एक घंटे के लिए, दो घंटे के लिए EPON और एसीटोन की एक 2:1 मिश्रण, और कम से कम छह घंटे के लिए अंत में शुद्ध EPON के साथ घुसपैठ द्वारा पीछा के साथ नमूने की घुसपैठ.
  7. फ्लैट एम्बेडिंग molds में प्लेस के नमूने ताजा शुद्ध EPON साथ भर दिया. oocytes इस तरह से उन्मुख हैं कि इंजेक्शन साइट के करीब नाभिक के पक्ष - इस मामले में oocytes dissected किया गया है कि पक्ष - sectioned पहले किया जाएगा. इस कदम चुना सब्सट्रेट के आयात visualizing का मौका अनुकूलन.
  8. अंत में, 60 में दो दिनों डिग्री सेल्सियस के लिए EPON polymerize
  9. आदेश में नमूने कल्पना करने के लिए, ब्लॉक छंटनी की और फिर sectioned एक ultramicrotome का उपयोग. धारा EM ग्रिड, मानक प्रक्रिया का उपयोग कर दाग पर स्थानांतरित कर रहे हैं, कल्पना और एक संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के साथ हम प्रोटोकॉल के इस भाग नहीं दिखाने के रूप में यह मानक EM प्रक्रिया है. .

भाग 5: प्रतिनिधि परिणाम:

यदि प्रोटोकॉल सफल रहा है, तो परमाणु लिफाफा (पूर्वोत्तर) और NPCs EM micrographs में स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए. सब्सट्रेट इंजेक्शन और इंजेक्शन और निर्धारण के बीच समय की राशि पर निर्भर करता है, एनपीसी के cytoplasmic चेहरे पर दिखाई सब्सट्रेट एनपीसी में, या एनपीसी के परमाणु चेहरे पर होना चाहिए.

चित्रा 1 से पता चलता है आसन्न cytoplasm (ग) और नाभिक एक Xenopus oocyte कि baculovirus AcMNPV के capsids के साथ अंतःक्षिप्त किया गया है से (एन), 4 डिग्री सेल्सियस incubated चार घंटे के लिए के साथ एक पार अनुभाग पूर्वोत्तर, और एम्बेडिंग और पतली अनुभाग के लिए संसाधित EM के रूप में वर्णित है. Arrowheads NPCs के लिए बिंदु. एनपीसी के cytoplasmic चेहरे पर एक capsid डॉकिंग एक सफेद तीर द्वारा संकेत दिया है.

इसके विपरीत में, चित्रा 2 आसन्न cytoplasm (ग) और है कि चूहे के parvovirus मिनट वायरस (MVM), चार घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated साथ अंतःक्षिप्त किया गया है एक Xenopus oocyte से नाभिक (एन) के साथ एक पार अनुभाग पूर्वोत्तर से पता चलता है, और एम्बेडिंग और पतली अनुभाग EM के रूप में वर्णित के लिए संसाधित. इस तकनीक का उपयोग, हमने पाया है कि MVM पूर्वोत्तर (कोहेन और Panté, 2005) के अवरोधों को प्रेरित. कोष्ठक पूर्वोत्तर में टूट जाता है संकेत मिलता है. Arrowheads NPCs के लिए बिंदु. ख्यात MVM पूर्वोत्तर के साथ जुड़े capsids सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.

चित्रा 1

चित्रा 1: पूर्वोत्तर आसन्न cytoplasm (ग) और Xenopus oocyte कि baculovirus एसी MNPV के capsids के साथ इंजेक्शन है, 4 में incubated से नाभिक (एन) के साथ पार अनुभाग के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ ° सी, चार घंटे के लिए और के लिए संसाधित एम्बेडिंग और पतली अनुभाग EM के रूप में वर्णित है. Arrowheads NPCs के लिए बिंदु. Capsids सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. स्केल पट्टी: 100 एनएम.

चित्रा 2

चित्रा 2: पूर्वोत्तर आसन्न cytoplasm (ग) और है कि चूहे के parvovirus मिनट वायरस (MVM), चार घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated साथ अंतःक्षिप्त किया गया है एक Xenopus oocyte से नाभिक (एन) के साथ पार अनुभाग के इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ , और एम्बेडिंग और पतली अनुभाग EM के रूप में वर्णित के लिए संसाधित. Arrowheads NPCs के लिए बिंदु. कोष्ठक पूर्वोत्तर में टूट जाता है संकेत मिलता है. ख्यात MVM पूर्वोत्तर के साथ जुड़े capsids सफेद तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. स्केल पट्टी: 100 एनएम.

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Discussion

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Xenopus EM पतली - सेक्शनिंग के साथ संयुक्त oocytes के Microinjection nucleocytoplasmic परिवहन के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक प्रभावी उपकरण है. इस प्रणाली cytoplasmic filaments और परमाणु टोकरी (Panté, 2006 द्वारा की समीक्षा की) जैसे एनपीसी के संरचनात्मक घटकों के साथ एक परमाणु आयात सब्सट्रेट के उदाहरण बातचीत के लिए एनपीसी के माध्यम से आयात के अलग चरणों, नक्शे के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह भी परमाणु नकल वायरस के परमाणु आयात (Rabe, एट अल, 2003, कोहेन और Panté, 2005 Panté और kann, 2002) का अध्ययन किया गया .

Cytoplasmic microinjection यहाँ दिखाया तकनीक का एक परिवर्तन एक परमाणु निर्यात सब्सट्रेट (Panté एट अल., 1997) के परमाणु microinjection है. परमाणु इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, oocytes एक microwell प्लेट में रखा जाता है, उन्मुख इसलिए कि पशु डंडे ऊपर चेहरा, और 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर incubated. अगले दिन, नाभिक जानवर पोल में एक थोड़ा उठाया क्षेत्र के रूप में दिखाई जानी चाहिए. नाभिक निर्यात सब्सट्रेट के लगभग 25 nl के साथ एक खड़ी कोण (की तुलना में बड़ा 45 डिग्री) पर microinjected हैं और एम्बेडिंग और EM पतली सेक्शनिंग के रूप में यहाँ वर्णित के लिए संसाधित.

यह भी ध्यान दें महत्वपूर्ण है कि जब एक परिवहन सब्सट्रेट है कि सीधे इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई नहीं देता है के साथ काम कर, यह अक्सर आवश्यक है जैसे कोलाइडयन सोने (Panté, 2006 द्वारा की समीक्षा की) एक इलेक्ट्रॉन अपारदर्शी कण के साथ सब्सट्रेट लेबल है.

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Acknowledgments

हम baculovirus AcMNPV प्रदान करने के लिए और उपयोगी चर्चा के लिए दाऊद Theilmann (प्रशांत कृषि खाद्य अनुसंधान केन्द्र, Summerland, ब्रिटिश कोलंबिया) धन्यवाद.

इस काम अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन (CFI), स्वास्थ्य (CIHR) अनुसंधान, स्वास्थ्य अनुसंधान (MSFHR) के लिए माइकल स्मिथ फाउंडेशन कनाडा के संस्थानों, और प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल () NSERC से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया .

References

  1. Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
  2. Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13, (2), 425-434 (2002).
  3. Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, (17), 9849-9854 (2003).
  4. Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86, (12), 3243-3252 (2005).
  5. Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
Xenopus Laevis oocytes के Microinjection
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Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes. J. Vis. Exp. (24), e1106, doi:10.3791/1106 (2009).More

Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes. J. Vis. Exp. (24), e1106, doi:10.3791/1106 (2009).

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