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Biology

Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection

doi: 10.3791/1106 Published: February 23, 2009

Summary

여기의 세포질 microinjection을 보여주

Abstract

얇은 sectioning 전자 현미경 (EM) 다음 Xenopus laevis의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 공부하고있는 훌륭한 시스템입니다. 때문에 대형 핵 및 핵 기공 단지 (NPCs)의 높은 밀도, 핵 수송 Xenopus oocyte의 시각에서 쉽게하실 수 있습니다. 원자력 수출입의 메커니즘에 많은 통찰력이 시스템의 사용 (Panté 2006 년 검토)를 통해 얻은되었습니다. 또한, 우리는 호스트 핵의 복제 여러 바이러스의 핵 수입 경로를 해부하다에 Xenopus의 oocytes의 microinjection을 사용했습니다.

여기서 우리는 핵 수입 기판과 Xenopus의 oocytes의 세포질 microinjection을 보여줍니다. 우리는 또한에 의해 시각화를위한 주입 oocytes의 준비를 보여 얇은 sectioning 해부, 탈수, 그리고 에폭시 수지에 포함 oocytes의 포함 포함 EM​​합니다. 마지막으로, 우리는 baculovirus Autographa californica의 nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) 또는 마우스 (MVM)의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스의 capsid와 microinjected, 그리고 기술의 잠재적인 응용 프로그램을 논의했습니다 oocytes에 대한 대표적인 결과를 제공합니다.

Protocol

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1 부 : microinjection에 대한 Xenopus의 oocytes의 작성

  1. 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM : 칼슘 무료 수정 바쓰의 호수에서 collagenase 용액 (5 MG / ML collagenase 20 ML을 포함하는 50 ML 원뿔 관에 Xenopus laevis의 난소의 작은 조각 (2cm에 대해) 장소 MgSO 4, 10 MM Hepes, 산도 7.5). Collagenase는 oocytes를 둘러싸고 뿌리 세포를 제거하는 데 사용됩니다.
  2. 쉐이크 플랫폼에서 튜브를 장소와 한 시간 동안 (100 RPM에서) 부드럽게 그것을 바위. 이번 collagenase 다른 많은에 따라 다릅니다. 따라서 일시간 후, oocytes의 작은 샘플을 가지고 해부 현미경으로 그들을 검사합니다. 제대로 드 folliculated oocytes 잘 서로 구분해야하고, 그것은 oocyte에 유리 바늘을 삽입하기 쉬운해야합니다. oocytes가 충분히 드 folliculated하지 않으면, 그들은 collagenase 솔루션에 남겨진 또 수시로 확인하고 있습니다.
  3. (MBS : 88 MM NaCl, 1 MM KCl, 0.82 MM MgSO 4, 0.33 MM 칼슘 (NO 3) 2, 0.41 MM CaCl 2, 10 MM Hepes, 산도 7.5) 수정 바쓰의 생리와 oocytes 세 번 씻으십시오, 그들을 전송 MBS 플러스 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 100 mm 직경 페트리 접시에. oocytes 지금 microinjected 준비하고 있습니다. microinjection은 또 하루에 수행되는 경우, 최대 일주일 4 ° C에서 oocytes를 저장합니다.
  4. 해부 현미경을 사용하여 microinjection을위한 성숙 단계의 VI oocytes를 선택합니다. 이러한 oocytes는 검은 동물 북반구와 크림 색깔의 식물 반구 사이 좋은 대조와 큰 있습니다.
  5. microwell 접시 (Nunc, 10 μl 잘 볼륨)로 성숙 단계 VI의 oocytes을 전송합니다. 이것은 oocytes의 undisrupted 흡입을 허용하도록 끝에 절단되어 피펫 팁와 200 μl pipettor을 사용하여 신중하게 이루어져야합니다.

2 부 : Xenopus의 oocytes의 Microinjection

  1. microinjection의 시각화에 투입, 1 % bromphenol 파란색의 작은 금액을 추가하여 microinjected 수 가져오기 기판을 준비합니다. 예를 들어, 우리는 기판의 10 μl로 bromphenol 청색 1 μl를 추가합니다.
  2. 100 mm 직경 페트리 접시에 Parafilm의 작은 스트립를 삽입하고, Parafilm 스트립에 주입하는 솔루션의 5 μl 드롭을 분배.
  3. 주입하는 솔루션으로 이전에 보정 주사 바늘 (주사 + Matic 풀러와 6.6 - μl micropipette 드루먼드를 당기는 얻은) 입력합니다. 이 경우, microinjector는 열망 모드에 설정됩니다. 주사 바늘을 보정하기 위해서는 바늘 50 NL의 볼륨에 해당하는 모든 0.5 mm를 도트 표시합니다.
  4. 세포질 주입 들어, 약 45도 각도에서 동물 반구에 아주 가까이, 식물 북반구에서 oocyte에 바늘의 끝부분을 삽입합니다. microinject에 microinjector 설정을 켜고, 그리고 수입 기​​판 50 NL 각 oocyte를 microinject. 바늘에 점 표시가 주입되어 기판의 크기를 모니터링하는 데 사용됩니다.
  5. MBS 가득한 작은 (35 - mm 직경) 페트리 접시에 주입 oocytes를 전송하고, NPCs와 관련된 수입 기​​판의 관찰을 허용하는 등 (시간 포인트가 너무 선택됩니다 시간의 원하는 금액을 실온에서 품어, 이러한 문제가 발생합니다 단백질과 적극적으로 NPC쪽으로 이송 아르 사용할 수있는 최신 바이러스 예방 프로그램으로 10 ~ 30 분,이 시간은 또한) 주사의 사이트와 단백질 / 바이러스의 크기에 따라 달라집니다.
  6. 배양이 완료되면, MBS의 2 % 글루 타 알데히드를 포함하는 4 - ML 유리관에 oocytes를 전송하고, 4 밤새 수정 ° C.

파트 3 : Xenopus의 oocytes의 해부

  1. 다음날, MBS와 oocytes에게 3 회 씻는다.
  2. 낮은 소금 버퍼 (1 ㎜ KCl, 0.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, pH를 7.5 LSB) 가득한 작은 페트리 접시에 oocytes를 전송합니다. 해부 현미경을 사용하고 핀셋을 해부하고, 각 oocyte에서 식물 장대를 제거합니다. 다른 쌍 식물 기둥을 제거하기 위해 가위처럼 사용할되는 동안 그것은 핀셋 한 쌍의와 해부되는 oocyte를 안정화하는 데 유용합니다. 이 시점에서 그것은 cytosol에서 파란색 가미의 존재에 의해 microinjection의 성공 여부를 평가하는 것이 가능합니다. 프로토콜은 성공적으로 microinjected 있던 oocytes 지속됩니다. 또한, 샘플은 EM에 대비하려면이 절개의 단계는 트리밍과 샘플을 sectioning 때 핵을 찾을 수가 훨씬 더 쉬워집니다.
  3. 실온에서 한 시간 만이라도 LSB의 2 % 글루 타 알데히드와 함께 다시 해부 oocytes을 수정.
  4. 고정 후, LSB와 해부 oocytes 세 번 씻으십시오.

4 부 : 삽입 및 EM을 희석 - Sectioning위한 속이고 Oocytes의 작성

  1. 우울증의 슬라이드를 해부 oocytes을 전송합니다. POS로 액체로 많은 기음(그래서 그들이 건조하지 않도록) 시블하고 신속하게이 2% 낮은 용융 아가로 오스와 해부 oocytes을 커버. 아가로 오스가 여전히 부드럽고 있지만, 서로 oocytes를 구분하기 위해 피펫 팁을 사용하고 각 oocyte가 아래로 얼굴 아니면되도록합니다 (옆으로).
  2. 아가로 오스는 약 10 분 동안 응고하도록 허용합니다. 아가로 오스는 굳은되면, 작은 조각 하나를 해부 oocyte를 포함하는 각에 아가로 오스를 잘라 면도날을 사용합니다.
  3. 4 ML 유리관에있는 아가로 오스 - 임베디드 oocytes를 삽입하고, 실온에서 한 시간 만이라도 1퍼센트 LSB에서 오소 4를 이후 수정.
  4. 샘플에게 LSB에 세 번 씻으십시오. 필요한 경우, ° C 하룻밤 4 샘플을 저장하고 다음날 프로토콜을 계속합니다.
  5. 순차적으로 (20 분 각 50, 70, 및 90 % 에탄올) 알코올의 오름차순 일련의 샘플을 탈수. 이것은 15 분 각각에 대해 100 %의 에탄올에 두 변경을합니다. 마지막 15 분 100 %의 아세톤과 샘플을 탈수.
  6. 적어도 6 시간 동안 2시 1분 두 시간 동안 Epon와 아세톤의 혼합, 그리고 마지막으로 순수 Epon으로하여 침투 다음 한 시간 만이라도 1:1 Epon의 혼합물 (Fluka) 및 아세톤과 샘플을 침투.
  7. 평면 포함 금형에 넣어 샘플 신선한 순수 Epon으로 가득. oocytes 같은 방식으로 지향하는 가까이 사출 사이트로 핵의 측면 -이 경우에는 해부되었습니다 oocytes의 측면은 - 먼저 sectioned 것입니다. 이 단계는 선택된 기판의 수입을 시각화의 기회를 최적화합니다.
  8. 마지막으로, 60 이틀 ° C.에 대한 Epon을 중합
  9. 샘플을 시각화하기 위해 블록이 ultramicrotome를 사용하여 다듬은 후 sectioned 있습니다. 섹션은 표준 절차를 사용하여 스테인드 EM의 격자,에 전송하고, 전송 전자 현미경으로 시각. 그것이 표준 EM 절차이므로 우리는 프로토콜의이 부분을 표시하지 않습니다됩니다.

제 5 부 : 대표 결과 :

프로토콜이 성공적 않은 경우 다음 핵 봉투 (NE)와 NPCs는 EM micrographs에 명확하게 표시해야합니다. 기판 주입 및 주입과 고정 사이의 시간의 양에 따라, 기판은 NPC에서 또는 NPC의 핵 얼굴, NPC의 세포질 얼굴을 볼 수 있습니다.

그림 1은 4 시간 동안 ° C 4 incubated baculovirus AcMNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE, 그리고 퍼가기 얇은 섹션에 대한 처리를 보여줍니다 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NPC의 세포질 얼굴 capsid 도킹은 흰색 화살표로 표시됩니다.

반대로, 그림 2는 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 단면 NE를 보여줍니다, 그리고 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 이 기법을 사용, 우리는 MVM은 NE (코헨과 Panté, 2005)의 혼란을 유도 것으로 나타났습니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다.

그림 1

그림 1 : 4 incubated, baculovirus AC MNPV의 capsids로 주입되어 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경 ° 네 시간 동안 C, 그리고에 대한 처리 퍼가기과 얇은 부분 EM은 설명했다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. Capsids은 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM.

그림 2

그림 2 : 네 시간 동안 실온에서 incubated 마우스의 파르 보 바이러스의 할인 바이러스 (MVM)으로 주사되어있는 Xenopus의 oocyte에서 인접 세포질 (C)과 핵 (N)와 NE의 단면의 전자 현미경과 삽입 및 EM과 같이 설명 얇은 섹션을 처리했습니다. 화살촉은 NPCs를 가리 킵니다. 괄호는 NE에 휴식을 나타냅니다. NE와 관련된 Putative MVM의 capsids는 흰색 화살표로 표시됩니다. 스케일 바 : 100 NM.

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Discussion

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얇은 sectioning EM과 함께 Xenopus의 oocytes의 Microinjection은 nucleocytoplasmic 전송을 연구를위한 매우 효과적인 도구입니다. 이 시스템은 같은 세포질 섬유와 핵 바구니 (Panté 2006에서 검토)로 NPC의 구조 구성 요소와 핵 수입 기​​판의 예를 들어 상호 작용에 대해, NPC를 통해 수입의 서로 다른 단계를 매핑하는 데 사용되었습니다. 또한 원자력 복제 바이러스의 핵 수입 (; 레이브 외, 2003;. 코헨과 Panté 2005 Panté와 칸, 2002) 연구에 사용되고 있습니다.

여기에 표시된 세포질 microinjection 기법 중 하나는 변형 핵 수출 기판 (Panté 외., 1997)의 핵 microinjection입니다. 핵 주사를 수행하려면, oocytes는 동물 채를가 얼굴 있도록 지향, microwell 접시에 배치, 4 ° C 하룻밤에 incubated 수 있습니다. 그 다음날, 핵은 동물 극에서 약간 제기 구역으로 표시되어야합니다. 핵은 가파른 (보다 큰 45도) 각도로 수출 기판의 약 25 NL과 microinjected하고 삽입하고 여기에 설명된 EM을 박막은 sectioning에 대한 처리됩니다.

전자 현미경으로 직접 보이지 않는 전송 기판을 다루는 경우가 종종 이러한 콜로이드 금 (Panté 2006 년 검토)으로 전자 - 불투명한 입자와 기판 레이블을하는 데 필요한 점에 유의하는 것도 중요하다.

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Acknowledgments

우리는 baculovirus의 AcMNPV를 제공하고 도움 토론 데이비드 Theilmann을 (태평양 아그리 - 식품 연구 센터, 섬머, 브리티시 컬럼비아) 감사드립니다.

이 작품은 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI), 보건 연구 (CIHR), 보건 연구 (MSFHR)의 마이클 스미스 재단의 캐나다 연구소, 그리고 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회 (NSERC)에서 부여로 지원이 .

References

  1. Panté, N. Use of intact Xenopus oocytes in nucleocytoplasmic transport studies. Methods Mol. Biol. 322, 301-314 (2006).
  2. Panté, N., Kann, M. Nuclear pore complex is able to transport macromolecules with diameters of about 39 nm. Mol. Biol. Cell. 13, (2), 425-434 (2002).
  3. Rabe, B., Vlachou, A., Panté, N., Helenius, N., Kann, M. Nuclear import of hepatitis B virus capsids and release of the viral genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, (17), 9849-9854 (2003).
  4. Cohen, S., Panté, N. Pushing the Envelope: Microinjection of MVM into Xenopus oocytes causes damage to the nuclear envelope. J. Gen. Virol. 86, (12), 3243-3252 (2005).
  5. Panté, N., Jarmolowski, A., Izaurralde, E., Sauder, U., Baschong, W., Mattaj, I. W. Visualizing nuclear export of different classes of RNA by electron microscopy. RNA. 3, 498-513 (1997).
Xenopus Laevis의 Oocytes의 Microinjection
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Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes. J. Vis. Exp. (24), e1106, doi:10.3791/1106 (2009).More

Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus Laevis Oocytes. J. Vis. Exp. (24), e1106, doi:10.3791/1106 (2009).

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