Summary
La microinjection est une méthode bien établie et efficace pour introduire des substances étrangères dans des embryons de poisson zèbre fécondé. Ici, nous démontrons une technique de microinjection robustes pour effectuer une surexpression d'ARNm, et morpholino oligonucléotides études de génétique chez le poisson zèbre knockdown.
Abstract
Un outil essentiel pour étudier le rôle d'un gène au cours du développement est la capacité à effectuer inactivation génique, surexpression, et des études misexpression. Dans le poisson zèbre (
Protocol
Partie 1: Préparation de micropipettes, et les plaques de la chambre de microinjection
- Fabriquer micropipettes en chauffant et en tirant des tubes capillaires en verre borosilicate (World Precision Instruments, Inc, 1B100-4) dans un dispositif extracteur micropipette (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97). Conserver dans une boîte de Pétri sur le dessus d'une petite quantité d'argile ou de ruban adhésif.
- Verser 1,5% d'agarose (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00500) dans des plaques de milieu 1x E3 moulé avec des creux en forme de coin qui servira une méthode facile pour la tenue des embryons lors de l'injection (comme décrit dans 'Le Livre Zebrafish ") 1. Laisser les plaques d'agar chambre de solidifier avant l'utilisation et la conserver à 4 º C.
Partie 2: Préparation de l'ARN
Une approche puissante pour les études de la fonction des gènes est de microinject ARN transcrit in vitro plafonnés dans embryons de poissons zèbres. Plafonné ARN se comporte comme ARNm eucaryotes trouvés in vivo en raison de la présence de l'analogue de la PAC. Chercheurs Zebrafish systématiquement utiliser cette méthode pour surexprimer ou misexpress leur gène d'intérêt. Dans cette démonstration, nous allons microinject une transcription EGFP-marqués et l'utilisation d'embryons vivre ensemble-GFP-expression comme un affichage visible pour une injection réussie.
- Effectuer une étude in vitro de la PAC réaction de transcription ARN sur votre relevé de notes d'intérêt. Dans notre laboratoire, nous avons l'habitude d'insérer un ADNc d'intérêt dans un vecteur pCS2 + et effectuer une réaction de synthèse in vitro de grandes quantités d'ARN coiffé en utilisant le kit mMessage mMachine SP6 (Ambion, Inc, AM1340).
- Purifier l'échantillon d'ARN en l'exécutant à travers le kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc, 74104) ou par le phénol: extraction au chloroforme et précipitation isopropanol.
- Soigneusement déterminer la concentration de la préparation d'ARN et de stocker à -80 º C jusqu'à utilisation.
- Le jour de l'injection, le dégel de l'échantillon d'ARN, vortex légèrement et centrifuger brièvement.
- Préparer une solution de travail avec de l'eau stérile et une concentration finale de 0,025 à 0,050% de rouge de phénol (Sigma-Aldrich, P0290). Rouge de phénol sert de marqueur visible pour l'injection de la solution dans l'embryon. Dans cet article, nous allons préparer une solution de travail de 100 ARNm EGFP ng / uL avec le rouge de phénol à 0,050%.
- Gardez l'échantillon de travail sur la glace et le retour des stocks ARN à -80 ° C.
- Passez à la partie 4 lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon.
Partie 3: Préparation du morpholino
Morpholino oligonucléotides antisens sont largement utilisés pour modifier l'expression des gènes en bloquant la traduction d'une protéine cible ou en modifiant l'épissage de pré-ARNm 2,3. Morpholinos dans le poisson zèbre servir d'outil de la génétique inverse puissante en faisant tomber la fonction des gènes. Dans cet article, nous allons microinject un oligo morpholino ciblé au site d'initiation de translation de PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Basé sur le travail déjà établies, nous nous attendons à des embryons injectés au phénotypiquement imitent PKD2 4 poissons mutants.
- Nous avons régulièrement afin 300 nmol d'un oligo morpholino spécialement conçu pour un gène d'intérêt à partir des outils Gene, LLC (Philomath, OU).
- Ajouter 100 ul d'eau stérile pour obtenir une solution à 3 mM. Aliquoter la solution et conserver à -20 ° C jusqu'à utilisation.
- Le jour de l'injection, chauffer la solution morpholino à 65 ° C pendant 5 minutes. Aligner refroidir sur glace immédiatement et centrifuger brièvement. Cette étape dénature toutes les structures secondaires dans les oligo et s'assure que la solution est totalement solubilisé.
- Préparer une solution de travail en diluant la solution dans l'eau stérile morpholino et une concentration finale de 0,025 à 0,050% de rouge de phénol. Dans cette démonstration, nous allons préparer une solution de travail de 0,50 mm PKD2 morpholino avec le rouge de phénol à 0,050%.
- Continuez à travailler solution à température ambiante.
- Passez à la partie 4 lorsque vous êtes prêt à injecter cet échantillon .----
Partie 4: Remplissage de la micropipette avec votre solution de travail
- Coupez l'extrémité distale d'une micropipette avec une pince ou une lame de rasoir chirurgicale afin de créer une ouverture qui est tout juste visible sous un microscope à dissection (Nikon Instruments, Inc, SM2645) à un grossissement de 50X.
- Placer 2 uL de votre solution de travail comme une goutte sur une lamelle.
- Fixez l'arrière d'une micropipette pour une seringue de 5 ml équipé avec des tubes sur une aiguille hypodermique et légèrement plonger l'extrémité distale de la micropipette dans votre goutte de solution de travail. Prenez soin de ne pas casser la pointe de la micropipette.
- Siphon la solution de travail à travers l'extrémité distale de la micropipette en tirant le piston de la seringue.
Partie 5: Calibrage du volume d'injection micropipette
- Déposer une goutte d'huile minérale (American bioanalytiques, Inc, AB00921-00025) sur une lame micromètre (FiSher, 12-561-SM1).
- Tournez sur la puissance et la fourniture d'air à la pression pulsé micro injecteur appareil (World Precision Instruments Inc, PV830).
- Fixez la micropipette pour le détenteur de l'appareil micropipette micro injecteur. L'injecteur est micro pression régulée et les rejets sont activées en appuyant sur la pédale.
- Sous le microscope de dissection, de tester le volume d'injection en utilisant l'injecteur micro à placer une goutte de votre solution de travail sur l'huile micromètre. Mesurez le diamètre de la goutte comme il flotte comme une sphère sur le dessus de l'huile.
- Ajustez la durée et la pression d'injection de bien calibrer votre volume d'injection. Cette étape aides à la reproductibilité de l'expérience de microinjection. Dans cette démonstration, tous les micro-injections seront faites avec un diamètre d'une goutte de 0,15 mm (environ 1,76 nL en volume).
- Une fois votre volume d'injection a été calibré, utilisez le "hold" bouton sur le micro injecteur pour empêcher le remblayage et la fuite de la micropipette.
Partie 6: Préparation du poisson zèbre fécondés pour la microinjection
- Le poisson zèbre au hasard compagnon dans les premières heures de chaque matin. Recueillir des embryons au stade 1-cellule et les placer dans 1x moyennes E3.
- Aide d'une pipette de transfert de 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524), organiser les embryons ainsi que les auges en forme de coin dans la chambre de plaques de micro-injection.
- Retirez le support de telle sorte que les embryons sont immergés et non superficiellement inondés. Cette étape aides dans le règlement des embryons au fond des creux, ainsi que dans la pénétration du chorion par la micropipette.
Partie 7: microinjection dans le chorion
- Manipuler les embryons à la micropipette pour que le cytoplasme de l'embryon au stade 1-cellule est visible sous le microscope à dissection. Prenez soin de ne pas casser la pointe de la micropipette.
- Pénétrer le chorion puis le jaune avec la micropipette afin d'injecter dans l'embryon. Dans cette démonstration, nous serons les premiers micro-injection dans le jaune juste en dessous de la cellule, et permettre l'écoulement cytoplasmique et la diffusion d'apporter la solution de travail dans la cellule. Ce flux est visible en raison de la rouge de phénol ajoutée à la solution de travail.
- Nous allons également démontrer l'injection directe dans le cytoplasme des cellules. Micro-injection directe dans la cellule est plus robuste, mais de temps que l'orientation appropriée et l'embryon technique de microinjection est nécessaire. Comme la membrane cellulaire est plus rigoureux que la membrane du jaune, il est souvent plus rapide pour entrer dans la micropipette dans le jaune pour atteindre le cytoplasme de la cellule. Orienter le pôle animal vers le fond de l'auge et de travailler avec les mains stables peut aider à cette méthode d'injection.
- Après microinjection, placer les embryons dans une boîte de Pétri avec un milieu de l'E3 et les incuber à 28,5 ° C pour un développement normal.
- Au cours des prochaines heures et les jours de développement embryonnaire, d'observer les embryons pour votre phénotypes d'intérêt.
Partie 8: Les résultats représentatifs
Surexpression d'ARNm EGFP: Pour vérifier le succès de la micro-injection, nous allons suivre l'expression de la GFP dans les embryons en développement commence au stade du bouclier (~ 6 HPF) par la microscopie par fluorescence in vivo entier embryon (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Expression de la construction est la plus forte au cours des événements précoces du développement embryonnaire et diminue souvent pendant le développement que l'injection de l'ARN plafonné est progressivement dégradée et dépend de la stabilité de la protéine exprimée.
PKD2 translationnelle bloquant morpholino: Basé sur les résultats publiés précédemment, nous prévoyons que le PKD2 morphants pour imiter la courbure dorsale du corps axe comme dans PKD2 zèbre mutant et kystes rénaux présent à environ 2 - 3 dpf 4.
Figure 1: Les résultats représentatifs de la micro-injection d'ARNm EGFP et PKD2 août morpholino. (A) Les embryons ont été microinjectés TAB au stade 1-cellule avec 0,17 ng d'ARNm EGFP et visualisées à 1 dpf pour la GFP in vivo l'expression. (B, c) les embryons ont été microinjectés TAB au stade 1-cellule avec ~ 1,7 nl d'une PKD2 translationnelle bloquant morpholino à 0,50 mM et a marqué pour la courbure dorsale du corps à 4 dpf.
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Discussion
Microinjection dans des embryons de poisson zèbre est une technique bien établie et solide pour explorer le rôle d'un gène particulier dans le développement. Les applications incluent la surexpression, misexpression, et des dosages knockdown de votre gène d'intérêt ainsi que l'analyse épistatique entre les gènes multiples. Microinjection chez le poisson zèbre a été largement utilisé pour générer des animaux transgéniques, et la cartographie du destin cellulaire au début embryons blastula 5,6,7,8,9. En outre, l'application de cette technique sert comme une étape clé dans la génération des cellules germinales chimères par des méthodes de transplantation de cellules 10.
Une méthode alternative pour explorer le phénotype d'un gène «gain de fonction» est de microinject formes constitutivement active de ce gène. En outre, les pseudo d'un gène «perte de fonction« phénotype peut être exploré par microinjection d'dominante formes négatives de ce gène. Microinjection dans des embryons de poisson zèbre peut également inclure l'ADN et des petites molécules 11,12.
Une étape importante dans cette technique de microinjection est la qualité de l'aiguille micropipette. Nous faisons de notre micropipette de tubes capillaires en forme par un dispositif extracteur pipette. Il est essentiel que l'extracteur de la pipette est correctement étalonnés pour donner la forme d'aiguille optimale et la taille. Micropipettes qui sont trop longs et étroits souvent manquent de rigidité, se cassent facilement et peinent à pénétrer le chorion et le jaune. Micropipettes court sont souvent plus enclins à endommager l'embryon au cours de microinjection.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le NIH et PKD Foundation pour ZS. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées en fonction de Yale Centre de Ressources animales (YARC) et institutionnel de protection des animaux et utilisation comité (IACUC) des lignes directrices.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
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