Summary
Mikroenjeksiyon döllenmiş zebrafish embriyolar içine yabancı maddeler tanıtmak için bir köklü ve etkili bir yöntemdir. Burada, mRNA aşırı ekspresyonu gerçekleştirmek için sağlam bir mikroenjeksiyon tekniği ve morfolino oligonükleotid gen devirme çalışmaları zebrafish göstermektedir.
Abstract
Geliştirme sırasında bir genin rolünün araştırılması için gerekli bir araç gen demonte, aşırı ekspresyonu ve misexpression çalışmalar gerçekleştirmek için yeteneğidir. Zebrafish yılında (
Protocol
Bölüm 1: mikropipetler hazırlanması ve mikroenjeksiyon odası plakalar
- Isıtma ve borosilikat cam kapiller tüplerin (Dünya Precision Instruments, Inc, 1B100-4) çekerek bir mikropipet çektirmenin cihazı (Sutter Instruments Inc, Flaming / Brown P-97) mikropipetler imal. Az miktarda kil veya yapışkan bant üstünde bir Petri kabındaki saklayın.
- (Zebra balığı Kitap "ta anlatıldığı gibi), enjeksiyon sırasında embriyoların tutmak için kolay bir yöntem olarak hizmet verecek kama şeklindeki olukları ile kalıp 1x E3 orta plakalar% 1.5 agaroz (American Bioanlytical, Inc, AB00972-00.500) dökün 1. agar odasına plakalar 4 º C'de kullanımı ve mağaza önce kuvvetlendirmek
Bölüm 2: RNA hazırlanması
Zebrafish embriyoların in vitro kapaklı transkripsiyonu RNA gen fonksiyon çalışmaları için güçlü bir yaklaşım microinject. Kapaklı RNA CAP analog varlığı nedeniyle in vivo bulundu ökaryotik mRNA'ların benzer şekilde davranır. Zebra balığı araştırmacılar rutin kendi ilgi gen eksprese veya misexpress için bu yöntemi kullanmaktadır. Bu gösteri, bir EGFP etiketli transkript microinject ve başarılı bir enjeksiyon için görünür bir okuma olarak canlı embriyo tüm GFP-ifade kullanmak.
- In vitro CAP RNA transkripsiyonu tepki ilgi transkript bir gerçekleştirin. Laboratuvarda rutin bir pCS2 + vektör ilgi bir cDNA yerleştirin ve kapaklı RNA mMessage mMachine SP6 kiti (Ambion, Inc, AM1340) kullanarak büyük miktarda in vitro sentez reaksiyon gerçekleştirilir.
- Purify RNA örneği RNeasy Mini kiti (Qiagen, Inc 74.104) ile çalışan veya fenol: kloroform ekstraksiyonu ve izopropanol yağış.
- Dikkatli bir şekilde kullanıma hazır olana kadar -80 º C'de RNA hazırlık ve mağaza konsantrasyonu belirler.
- Enjeksiyon gününde, RNA örnek, girdap hafifçe Çözülme ve kısaca aşağı doğru döndürün.
- 0.050% fenol kırmızısı (Sigma-Aldrich Co, P0290) - Steril su ve 0.025 bir final konsantrasyon ile bir çalışma çözeltisi hazırlayın. Fenol kırmızı görünür bir çözüm embriyo içine enjeksiyon için işaretleyici olarak hizmet vermektedir. Bu makalede, biz% 0.050 fenol kırmızısı ile 100 ng / uL EGFP mRNA çalışan bir solüsyon hazırlanır.
- -80 ° C'ye kadar buz ve dönüş RNA stok çalışma örneği tutun
- Bölüm 4 Bu örnek enjekte etmek için hazır geçin.
Bölüm 3: morfolino hazırlanması
Morfolino antisens oligonükleotidler hedeflenen protein çeviri bloke ederek veya pre-mRNA ekleme 2,3 değiştirerek gen ekspresyonu yaygın olarak değiştirmek için kullanılır. Zebrafish Morpholinos genin fonksiyonu aşağı vurma güçlü bir ters genetik aracı olarak hizmet vermektedir. Bu makalede, biz pkd2 translasyonel başlatılması sitesi (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 ') hedef alan bir morfolino oligo microinject. Daha önce kurulan çalışma dayanarak, enjekte edilen embriyolar fenotipik pkd2 mutant balık 4 taklit etmek için bekliyoruz.
- Biz rutin olarak özel bir gen Gen Araçlar faiz, LLC (Philomath OR) için tasarlanmış bir morfolino oligo 300 nmol sipariş.
- 3 mM stok solüsyonu yapmak için 100 uL steril su ekleyin. Kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'de kısım çözüm ve mağaza.
- Enjeksiyon gününde, 65 morfolino çözümü ısı ° C 5 dakika. Hemen buz üzerine serin çekin ve kısaca döndürün. Bu adım, oligo herhangi bir ikincil yapılar yıkılır ve çözüm tamamen çözünür olmasını sağlar.
- 0.050% fenol kırmızı - steril su ve 0.025 final konsantrasyonda morfolino çözüm seyreltilmesi ile çalışan bir çözüm hazırlayın. Bu gösteri,% 0.050 fenol kırmızı ile 0.50 mM pkd2 morfolino bir çalışma çözeltisi hazırlanıyor.
- Oda sıcaklığında çözüm çalışmaya devam edin.
- Bu örnek enjekte etmek için hazır Bölüm 4 geçin .----
Bölüm 4: çalışma çözeltisi ile mikropipet Dolum
- Forseps ile mikropipet distal ucu veya 50X büyütme (Nikon Instruments, Inc SM2645) diseksiyon mikroskobu altında görünür bir açılış oluşturmak için bir cerrahi jilet kesin.
- Place 2 lamel üzerine bir damla olarak çalışan çözüm uL.
- 5 ml şırınga derialtı iğne ve biraz çalışma çözüm damla içine daldırın mikropipet distal ucu boru ile donatılmış bir mikropipet geri takın. Mikropipet ucu kırmamaya özen gösterin.
- Şırınganın pistonu çekerek mikropipet distal sonuna kadar çalışma çözeltisi Sifon.
Bölüm 5: mikropipet enjeksiyon hacmi Kalibre
- Mikrometre slayt üzerinde mineral yağ, bir damla (Amerikan Biyoanalitik, Inc, AB00921-00025) (Fi yerleştirinsher, 12-561-SM1).
- Basınç darbeli mikro enjektör cihazları (Dünya Precision Instruments Inc, PV830) güç ve hava kaynağı açın.
- Mikropipet mikropipet sahibine mikro enjektör aparat takın. Mikro enjektör basınç düzenlenir ve deşarj ayak pedalına basarak aktive edilir.
- Diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon hacmi, çalışma çözüm mikrometre yağı, üzerine bir damla yere mikro enjektör kullanarak test edin. Yağın üstüne bir küre olarak yüzer gibi damla çapı ölçün.
- Süresi ve enjeksiyon basıncı enjeksiyon hacmi dikkatle kalibre etmek için ayarlayın. Bu adım, mikroenjeksiyon deney tekrarlanabilirlik yardımcı olur. Bu gösteri, tüm microinjections bir damla çapı 0,15 mm (hacmi yaklaşık 1.76 nL) ile yapılacaktır.
- Enjeksiyon hacmi kalibre edildikten sonra, dolgu ve mikropipet sızmasını önlemek için "Tut" düğmesi mikro enjektör kullanın.
Bölüm 6: mikroenjeksiyon için hazırlanması döllenmiş zebrafish embriyolar
- Zebra balığı her sabah ilk birkaç saat içinde rastgele arkadaşı olacak. 1-hücreli aşamada embriyoların toplayın ve 1x E3 orta koyun.
- 3 ml transfer pipetlemeyin (Becton Dickinson Laboratuvar, 357.524) kullanarak, mikroenjeksiyon odası plakalar kama şeklindeki olukları boyunca embriyolar düzenliyoruz.
- Embriyoların basık batık ve sular değil böylece orta çıkarın. Bu adım, sıra mikropipet koryon penetrasyon olukları alt embriyolar çözümünde yardımcı olur.
Bölüm 7: koryon ile Mikroenjeksiyon
- 1-hücreli aşamada embriyo sitoplazma diseksiyon mikroskop altında görülebilir böylece mikropipet embriyolar işleyin. Mikropipet ucu kırmamaya özen gösterin.
- Mikropipet koryon ve sonra sarısı embriyonun içine enjekte etmek için nüfuz. Bu gösteri, ilk doğrudan hücre altında sarısı içine microinjecting ve hücre içine çalışma çözüm getirmek için izin sitoplazmik akışı ve difüzyon. Bu akış, emekçi çözüm için fenol kırmızısı nedeniyle görünür.
- Ayrıca hücre sitoplazma içine direkt enjeksiyon gösterecektir. Hücre içine doğrudan mikroenjeksiyon daha güçlü ama uygun embriyo yönelim ve mikroenjeksiyon tekniği gereklidir gibi zaman alıcı. Hücre zarı, yumurta zarı daha sıkı olduğu için, hücre sitoplazma ulaşmak için yumurta sarısı ile mikropipet girmek için genellikle daha hızlıdır. Hayvan kutup çukur alt kısmına doğru yönlendirmek ve kararlı ellerle bu enjeksiyon yöntemi yardımcı olabilir.
- E3 orta mikroenjeksiyon sonra, embriyoların bir Petri kabı içine yerleştirin ve 28,5 az inkübe ° C normal gelişimi için.
- Embriyo gelişiminin sonraki birkaç saat ve gün içinde, ilgi fenotipleri embriyolar gözlemliyoruz.
Bölüm 8: Temsilci sonuçları
EGFP mRNA aşırı ekspresyonu: mikroenjeksiyon başarısını doğrulamak için, biz (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII) in vivo embriyo tüm floresan mikroskopi kalkan aşamada (~ 6 hpf) başlayarak, gelişmekte olan embriyolar, GFP ifade izleyecek . Yapı İfade erken embriyonik gelişim olaylar sırasında en güçlü ve genellikle geliştirme sırasında enjekte kapaklı RNA yavaş yavaş düşer ve ifade protein istikrar bağlı olarak azalacaktır.
pkd2 translasyonel engelleme morfolino: daha önce yayınlanan sonuçlara dayanarak, yaklaşık 2 pkd2 mutant Zebra balığı ve mevcut böbrek kistleri bulunan dorsal vücut ekseni eğrilik pkd2 morphants - 3 dpf'e 4 taklit etmek için bekliyoruz.
Şekil 1: EGFP mRNA ve pkd2 Ağustos morfolino mikroenjeksiyon Temsilcisi sonuçlar. (A) TAB embriyolarının EGFP mRNA 0.17 ng 1-hücreli aşamada microinjected ve in vivo GFP ifade 1 dpf'e görüntülendi. (B, c) TAB embriyolarının 0.50 mM pkd2 translasyonel engelleme morfolino ~ 1.7 nl 1-hücreli aşamada microinjected ve 4 dpf'e dorsal vücut eğriliği için attı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebrafish embriyolar içine mikroenjeksiyon gelişimi belirli bir genin rol keşfetmek için köklü ve sağlam bir tekniktir. Uygulamalar ilgi yanı sıra birden fazla genin arasındaki epistatik analizi gen aşırı ekspresyonu, misexpression ve demonte deneyleri içerir. Transgenik hayvanlar oluşturma ve erken blastula embriyolar 5,6,7,8,9 hücre kaderi haritalama zebrafish içinde Mikroenjeksiyon yaygın olarak kullanılmaktadır. Buna ek olarak, bu tekniğin uygulama hücre nakli yöntemleri 10 germ-line kimeralar üreten önemli bir adım olarak görür.
Bir gen 'kazanç-fonksiyon' fenotip keşfetmek için alternatif bir yöntem, bu genin yapısal olarak aktif formları microinject. Buna ek olarak, bir gen sözde 'fonksiyon kaybı-fenotip, aynı genin baskın olumsuz formları mikroenjeksiyon ile araştırılmalıdır. Zebrafish embriyolar mikroenjeksiyon de DNA ve küçük moleküller 11,12 içerebilir.
Bu mikroenjeksiyon tekniği kritik bir adım mikropipet iğne kalitesi. Biz bir pipetle çektirmenin cihaz tarafından şekillenen kılcal tüpler mikropipet olun. Pipet çektirmesi gerektiği gibi, optimum iğne şekli ve boyutu verim kalibre esastır. Çok uzun ve sık sık eksikliği katılık dar mikropipetler, kolayca kırılabilir ve koryon ve yumurta sarısı nüfuz mücadelesi. Kısa mikropipetler genellikle mikroenjeksiyon sırasında embriyo zarar daha yatkındır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Bu çalışma, ZS, Ulusal Sağlık Enstitüsü ve PKD vakıf tarafından desteklenmiştir. Yale Hayvan Kaynakları Merkezi (YARC) ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) yönergeleri doğrultusunda tüm hayvan deneyleri yapılmıştır.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
||
| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
