Summary
Mikroinjektion ist eine gut etablierte und effektive Methode für die Einführung von Fremdstoffen in befruchtete Zebrafisch-Embryos. Hier zeigen wir eine robuste Mikroinjektionstechnik für die Durchführung von mRNA-Überexpression und Morpholino-Oligonukleotid-Gen Knockdown Studien im Zebrafisch.
Abstract
Ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung der Rolle eines Gens während der Entwicklung ist die Fähigkeit, Gen Knockdown, Überexpression und misexpression Studien durchzuführen. In Zebrafisch (
Protocol
Teil 1: Herstellung von Mikropipetten und die Mikroinjektion Kammerplatten
- Fertigen Mikropipetten durch Erhitzen und Ziehen Borosilikatglas Kapillaren (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in einer Mikropipette Abziehvorrichtung (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Shop in einer Petrischale auf der kleinen Menge von Ton oder Klebeband.
- Gießen Sie 1,5% Agarose (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) in 1x E3 Medium-Platten mit keilförmigen Rinnen, die als eine einfache Methode zur Aufnahme des Embryos während der Injektion dienen (wie in "Der Zebrafisch Book" beschrieben) wird geformt 1. Lassen Agar Kammerplatten erstarren vor dem Gebrauch und Lagerung bei 4 º C.
Teil 2: Herstellung von RNA
Ein leistungsfähiges Konzept für die Gen-Funktions-Studien ist es, in vitro transkribiert capped RNA in Zebrafisch-Embryonen microinject. Capped RNA verhält sich ähnlich wie eukaryotischen mRNAs in vivo durch die Anwesenheit der GAP analog gefunden. Zebrafisch Forscher routinemäßig nutzen diese Methode, um überexprimieren oder misexpress ihre Gen von Interesse. In dieser Demonstration werden wir microinject eines EGFP-markierten Transkript und Nutzung leben ganzen Embryo GFP-Expression als eine sichtbare Anzeige für eine erfolgreiche Injektion.
- Führen Sie eine In-vitro-CAP RNA-Transkription Reaktion auf Ihrem Transkript des Interesses. In unserem Labor haben wir routinemäßig legen Sie eine cDNA von Interesse in einen pCS2 + Vektor, und führen Sie ein in vitro-Synthese-Reaktion von großen Mengen von capped RNA mit dem mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion, Inc., AM1340).
- Purify der RNA-Probe, indem Sie es durch die RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) oder durch Phenol: Chloroform-Extraktion und Isopropanol-Fällung.
- Sorgfältig bestimmen die Konzentration der RNA-Präparation und Lagerung bei -80 º C bis zur Verwendung.
- Am Tag der Injektion, tauen die RNA-Probe, Wirbel leicht und Spin-down kurz.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung mit sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot (Sigma-Aldrich Co., P0290). Phenolrot dient als sichtbare Markierung für die Injektion der Lösung in den Embryo. In diesem Artikel werden wir eine funktionierende Lösung von 100 ng / ul EGFP mRNA mit 0,050% Phenolrot vorzubereiten.
- Halten Sie arbeiten Probe auf Eis und zurück RNA Lager bis -80 ° C.
- Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren.
Teil 3: Herstellung von Morpholino
Morpholino Antisense-Oligonukleotide sind weit verbreitet, um die Genexpression durch die Blockierung Übersetzung eines Zielproteins oder durch die Änderung pre-mRNA-Spleißen 2,3 zu ändern. Morpholinos in der Zebrafisch als leistungsfähige reversen Genetik Werkzeug dienen, indem man den Gen-Funktion. In diesem Artikel werden wir microinject eine Morpholino Oligo gezielt auf die Translation zur Website von PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Basierend auf vorher festgelegten Arbeiten erwarten wir, dass die injizierten Embryonen phänotypisch imitieren PKD2 mutierten Fische 4.
- Wir routinemäßig um 300 nmol eines Morpholino Oligo speziell für ein Gen von Interesse von Gene Tools, LLC (Philomath, OR) entwickelt.
- Add 100 uL sterilem Wasser zu einer 3 mM-Stammlösung zu machen. Aliquot der Lösung und bei -20 ° C bis zur Verwendung.
- Am Tag der Injektion Wärme der Morpholino-Lösung bei 65 ° C für 5 Minuten. Snap kühl auf Eis sofort und Spin kurz. Dieser Schritt denaturiert alle sekundären Strukturen in der Oligo und sorgt dafür, dass die Lösung vollständig gelöst.
- Bereiten Sie eine funktionierende Lösung durch Verdünnen der Morpholino-Lösung in sterilem Wasser und eine endgültige Konzentration von 0,025 bis 0,050% Phenolrot. In dieser Demonstration werden wir vorbereiten eine funktionierende Lösung von 0,50 mM PKD2 Morpholino mit 0,050% Phenolrot.
- Keep funktionierende Lösung bei Raumtemperatur.
- Fahren Sie mit Teil 4 als bereit, diese Probe zu injizieren .----
Teil 4: Füllen der Mikropipette mit Ihrem funktionierende Lösung
- Cut der distalen Spitze einer Mikropipette mit einer Pinzette oder einer chirurgischen Rasierklinge, um eine Öffnung, die gerade noch sichtbar unter einem Binokular (Nikon Instruments, Inc., SM2645) bei 50X Vergrößerung ist zu schaffen.
- Platz 2 uL Ihrer Gebrauchslösung wie ein Tropfen auf einem Deckglas.
- Befestigen Sie die Rückseite einer Mikropipette auf eine 5 ml-Spritze mit Schlauch auf einer Injektionsnadel und leicht untertauchen der distalen Spitze der Mikropipette in die Tropfen funktionierende Lösung ausgestattet. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen.
- Siphon der Arbeitslösung durch das distale Ende der Mikropipette, indem Sie den Kolben der Spritze.
Teil 5: Kalibrierung der Mikropipette Injektionsvolumen
- Geben Sie einen Tropfen Mineralöl (American Bioanalytische, Inc., AB00921-00025) auf einem Mikrometer slide (Fisher, 12-561-SM1).
- Schalten Sie die Stromversorgung und Luftzufuhr, um den Druck-gepulsten Mikro Injektorvorrichtung (World Precision Instruments Inc., PV830).
- Bringen Sie die Mikropipette auf die Mikropipette Inhaber der Mikro Injektorvorrichtung. Die Mikro-Injektor wird der Druck reguliert und Entladungen werden durch Drücken des Pedals aktiviert.
- Unter dem Dissektionsmikroskop, testen das Injektionsvolumen mit dem Mikro-Injektor zu einem Rückgang der funktionierende Lösung auf den Mikrometer-Öl statt. Messen Sie den Durchmesser der Tropfen, wie sie als eine Kugel auf der Oberseite des Öl schwimmt.
- Stellen Sie die Dauer und der Druck der Injektion sorgfältig kalibrieren Ihr Volumen der Injektion. Dieser Schritt hilft bei der Reproduzierbarkeit der Mikroinjektion Experiment. In dieser Demonstration werden alle microinjections mit einem Tropfen Durchmesser von 0,15 mm (ungefähr 1,76 nL in Volumen) durchgeführt werden.
- Sobald Ihr Injektionsvolumen kalibriert wurde, verwenden Sie die "Hold"-Knopf auf der Mikro-Injektor zur Verfüllung und undichte der Mikropipette zu verhindern.
Teil 6: Vorbereiten befruchtete Zebrafisch-Embryos für die Mikroinjektion
- Zebrafische nach dem Zufallsprinzip in den ersten Stunden des Morgens mate. Sammeln Embryonen im 1-Zell-Stadium und legen Sie sie in 1x E3 Medium.
- Mit einem 3 mL Transfer-Pipette (Becton Dickinson Labware, 357524), ordnen Sie die Embryonen an der keilförmigen Rinnen in die Mikroinjektion Kammerplatten.
- Entfernen Sie das Medium so, dass die Embryonen flach sind untergetaucht und nicht überflutet. Dieser Schritt hilft bei der Lösung des Embryos an der Unterseite der Tröge sowie in der Durchdringung des Chorion durch die Mikropipette.
Teil 7: Mikroinjektion durch das Chorion
- Bearbeiten Sie die Embryonen mit der Mikropipette, so dass das Zytoplasma der 1-Zell-Stadium Embryos sichtbar unter dem Binokular ist. Achten Sie darauf, die Spitze der Mikropipette zu brechen.
- Dringen in die Chorion und dann das Eigelb mit der Mikropipette, um in den Embryo zu injizieren. In dieser Demonstration werden wir zunächst Mikroinjektion in den Dotter direkt unterhalb der Zelle sein, und erlauben zytoplasmatische Strömung und Diffusion an die funktionierende Lösung in die Zelle zu bringen. Dieser Fluss wird sichtbar durch die Phenolrot hinzugefügt, um die funktionierende Lösung.
- Wir werden auch zeigen, direkte Injektion in das Zytoplasma. Die direkte Mikroinjektion in die Zelle ist robuster, aber zeitaufwendig, da richtige Embryo Orientierung und Mikroinjektionstechnik erforderlich ist. Da die Zellmembran ist strenger als die Dotterhaut, ist es oft schneller auf die Mikropipette durch das Eigelb geben, um Zytoplasma der Zelle zu erreichen. Die Ausrichtung der animalen Pol in Richtung Boden der Wanne und die Arbeit mit ruhige Hände können bei dieser Methode der Injektion zu unterstützen.
- Nach Mikroinjektion, legen Sie die Embryonen in einer Petrischale mit E3 mittel-und inkubieren sie bei 28,5 ° C für eine normale Entwicklung.
- Im Laufe der nächsten Stunden und Tage der Embryonalentwicklung, beobachten die Embryonen für Ihre Phänotypen von Interesse.
Teil 8: Repräsentative Ergebnisse
EGFP mRNA-Überexpression: Um zu überprüfen, den Erfolg der Mikroinjektion, überwachen wir die Expression von GFP in den sich entwickelnden Embryonen ab Schild Stufe (~ 6 hpf) durch in vivo whole-Embryo-Fluoreszenzmikroskopie (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expression des Konstrukts ist am starken während der frühen Ereignisse der embryonalen Entwicklung und wird oft während der Entwicklung schwinden, da die injizierten capped RNA wird allmählich abgebaut und hängt von der Stabilität des exprimierten Proteins.
PKD2 translationale-blocking Morpholino: Basierend auf den bisher veröffentlichten Ergebnissen erwarten wir, dass die PKD2 morphants zum dorsalen Körperachse Krümmung wie in PKD2 mutierte Zebrafische und Gegenwart Nierenzysten bei etwa 2 zu imitieren - 3 dpf 4.
Abbildung 1: Repräsentative Ergebnisse aus Mikroinjektion von EGFP mRNA und PKD2 August Morpholino. (A) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit 0,17 ng EGFP mRNA mikroinjiziert und visualisiert bei 1 dpf für in vivo GFP-Expression. (B, c) TAB Embryonen wurden bei der 1-Zell-Stadium mit ~ 1,7 nl einer PKD2 translationale blockiert Morpholino bei 0,50 mM mikroinjiziert und erzielte für die dorsale Körper Krümmung bei 4 dpf.
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Discussion
Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen ist eine gut etablierte und robuste Technik für die Erkundung der Rolle eines bestimmten Gens in der Entwicklung. Zu den Anwendungen gehören Überexpression misexpression und Knockdown Assays Ihrer Gen von Interesse als auch epistatisch Analyse zwischen mehreren Genen. Mikroinjektion in Zebrafisch wurde weithin für die Erzeugung transgener Tiere und Mapping-Zell-Schicksal in frühen Blastula Embryonen 5,6,7,8,9 verwendet. Darüber hinaus dient die Anwendung dieser Technik, die als ein wichtiger Schritt bei der Erzeugung von Keimbahn-Chimären durch Zelltransplantation Methoden 10.
Eine alternative Methode zur Entdeckung eines Gens 'gain-of-function "-Phänotyp ist konstitutiv aktiven Formen dieses Gens microinject. Darüber hinaus kann ein Gen ist pseudo "loss-of-function"-Phänotyp durch Mikroinjektion von dominant negativen Formen dieses Gens untersucht werden. Mikroinjektion in Zebrafisch-Embryonen können auch DNA und kleinen Molekülen 11,12.
Ein entscheidender Schritt in diese Mikroinjektionstechnik ist die Qualität der Mikropipette Nadel. Wir machen unsere Mikropipette aus Kapillaren mit einer Pipette Abziehvorrichtung geprägt. Es ist wichtig, dass die Pipette puller richtig kalibriert ist, um eine optimale Nadel Form und Größe zu erhalten. Mikropipetten, die zu lang und schmal mangelt es häufig an Steifigkeit, leicht brechen und den Kampf um das Chorion und Dotter eindringen. Short Mikropipetten sind häufig anfälliger für Schäden des Embryos während der Mikroinjektion.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH und PKD Stiftung ZS unterstützt. Alle Tierexperimente wurden nach Yale Tiere Resources Center (YARC) und Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) Richtlinien durchgeführt.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
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