Summary
Microiniezione è un metodo consolidato ed efficace per l'introduzione di sostanze estranee in embrioni di zebrafish fecondato. Qui, dimostriamo una tecnica robusta microiniezione per l'esecuzione di sovraespressione di mRNA, e morfolino oligonucleotide studi gene knockdown in zebrafish.
Abstract
Uno strumento essenziale per indagare il ruolo di un gene durante lo sviluppo è la capacità di eseguire knockdown gene, l'iperespressione, e gli studi misexpression. In zebrafish (
Protocol
Parte 1: Preparazione di micropipette, e piatti da camera microiniezione
- Fabbricare micropipette da riscaldamento e tirando tubi in vetro borosilicato capillari (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) in un dispositivo estrattore micropipetta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Conservare in una capsula di Petri in cima alla piccola quantità di argilla o di nastro adesivo.
- Versare 1,5% agarosio (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) a 1x piatti medio E3 stampato con depressioni a forma di cuneo che servirà come un metodo semplice per tenere gli embrioni durante l'iniezione (come descritto in 'Il libro Zebrafish ") 1. Lasciate piastre di agar camera di solidificare prima dell'uso e conservare a 4 ° C.
Parte 2: Preparazione di RNA
Un approccio potente per gli studi la funzione del gene è quello di microinject in vitro l'RNA trascritto ricoperto in embrioni di zebrafish. Capped RNA si comporta in modo simile a mRNA eucariotici presenti in vivo per la presenza della analogico PAC. Zebrafish ricercatori utilizzano abitualmente questo metodo per iperespressione o misexpress loro gene di interesse. In questa dimostrazione, ci sarà uno microinject EGFP-tagged trascrizione e l'uso dal vivo tutto-embrione GFP-espressione come una lettura visibile per una iniezione di successo.
- Eseguire un reazione in vitro la trascrizione dell'RNA PAC sul tuo trascrizione di interesse. Nel nostro laboratorio, abbiamo routine inserire un cDNA di interesse in un vettore pCS2 + ed eseguire un reazione di sintesi in vitro di grandi quantità di RNA ricoperto utilizzando la mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340).
- Purificare il campione di RNA mediante l'esecuzione attraverso il kit RNeasy Mini (Qiagen, Inc., 74104) o fenolo: estrazione con cloroformio e precipitazione isopropanolo.
- Accuratamente determinare la concentrazione del preparato RNA e conservare a -80 ° C fino al momento dell'utilizzo.
- Il giorno della iniezione, scongelare il campione di RNA, vortice leggermente e spin down brevemente.
- Preparare una soluzione di lavoro con acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,050% rosso fenolo (Sigma-Aldrich, P0290). Rosso fenolo serve come marcatore visibile per l'iniezione della soluzione in embrione. In questo articolo, si prepara una soluzione di lavoro di 100 ng / uL mRNA EGFP con il 0,050% rosso fenolo.
- Tenere campione lavorando su ghiaccio e rendimenti azionari RNA a -80 ° C.
- Procedere alla parte 4 quando è pronto per iniettare questo esempio.
Parte 3: Preparazione del morfolino
Morfolino oligonucleotidi antisenso sono ampiamente utilizzati per modificare l'espressione genica, bloccando la traduzione di una proteina bersaglio o modificando pre-mRNA splicing 2,3. Morpholinos nel zebrafish servire come un potente strumento di genetica inversa abbattendo la funzione del gene. In questo articolo, ci sarà uno microinject oligo morfolino mirato al sito di inizio traslazionale di PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Sulla base di lavoro stabiliti in precedenza, ci aspettiamo che gli embrioni iniettati per imitare fenotipicamente PKD2 4 mutanti di pesce.
- Noi di routine per 300 nmol di un oligo morfolino specificamente progettato per un gene di interesse da Strumenti Gene, LLC (Philomath, OR).
- Aggiungere 100 uL di acqua sterile per ottenere un 3 soluzione madre mM. Aliquota della soluzione e conservare a -20 ° C fino al momento dell'utilizzo.
- Il giorno della iniezione, riscaldare la soluzione morfolino a 65 ° C per 5 minuti. Scatto raffreddare su ghiaccio immediatamente e spin brevemente. Questo passo denatura le strutture secondarie nella oligo e assicura che la soluzione è completamente solubilizzato.
- Preparare una soluzione di lavoro diluendo la soluzione morfolino in acqua sterile e una concentrazione finale di 0,025-0,050% rosso fenolo. In questa dimostrazione, ci prepareremo una soluzione di lavoro di 0,50 mm PKD2 morfolino con il 0,050% rosso fenolo.
- Continuare a lavorare soluzione a temperatura ambiente.
- Procedere alla parte 4 quando è pronto per iniettare il campione .----
Parte 4: Riempimento della micropipetta con la soluzione di lavoro
- Tagliare la punta distale di una micropipetta con una pinza o una lametta chirurgico per creare un'apertura che è appena visibile sotto un microscopio da dissezione (Nikon Instruments, Inc., SM2645) con ingrandimento 50X.
- Posto 2 uL della soluzione di lavoro come una goccia su un vetrino.
- Fissare il retro di una micropipetta di una siringa da 5 ml dotato di tubi su un ago ipodermico e leggermente immergere la punta distale del micropipetta nella tua goccia di soluzione di lavoro. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta.
- Sifone la soluzione di lavoro attraverso l'estremità distale del micropipetta tirando lo stantuffo della siringa.
Parte 5: Calibrazione del volume di iniezione micropipetta
- Mettere una goccia di olio minerale (American Bioanalytical, Inc., AB00921-00025) su un vetrino micrometrico (FiSher, 12-561-SM1).
- Accendere e alimentazione di aria alla pressione pulsata micro-apparato iniettore (World Precision Instruments Inc., PV830).
- Fissare la micropipetta al titolare micropipetta dell'apparato micro iniettore. L'iniettore è micro pressione regolata e scarichi vengono attivate premendo il pedale.
- Sotto il microscopio dissezione, verificare il volume di iniezione utilizzando l'iniettore micro posto una goccia di soluzione di lavoro sul petrolio micrometro. Misurare il diametro della goccia in quanto galleggia come una sfera sulla parte superiore del petrolio.
- Regolare la durata e la pressione di iniezione di calibrare con attenzione il volume di iniezione. Questa fase aiuta la riproducibilità dell'esperimento microiniezione. In questa dimostrazione, tutte le microiniezioni sarà fatto con un diametro calo di 0,15 mm (circa 1,76 nL in volume).
- Una volta che il volume di iniezione è stata calibrata, utilizzare la manopola "Hold" sulla micro iniettore per prevenire il riempimento e la fuoriuscita della micropipetta.
Parte 6: Preparazione di embrioni di zebrafish fecondate per microiniezione
- Zebrafish in modo casuale compagno nelle prime ore di ogni mattina. Raccogliere embrioni a 1-cellula stadio e metterli in 1x medio E3.
- Usando una pipetta di trasferimento 3 ml (Becton Dickinson mediche di laboratorio, 357.524), organizzare gli embrioni lungo le depressioni a forma di cuneo in lastre camera di microiniezione.
- Rimuovere il supporto in modo che gli embrioni sono superficialmente sommerse e non allagata. Questa fase aiuta a risolvere gli embrioni al fondo del depressioni così come nella penetrazione del corion dalla micropipetta.
Parte 7: Microiniezione attraverso il corion
- Manipolare gli embrioni con la micropipetta in modo che il citoplasma della cellula embrionale 1-fase è visibile sotto il microscopio da dissezione. Fare attenzione a non rompere la punta della micropipetta.
- Penetrare il corion e poi il tuorlo con la micropipetta per iniettare l'embrione. In questa dimostrazione, ci sarà la prima microinjecting nel tuorlo direttamente sotto la cella, e permettono il flusso citoplasmatico e diffusione di portare la soluzione di lavoro all'interno della cellula. Questo flusso è visibile a causa del rosso fenolo aggiunto alla soluzione di lavoro.
- Ci sarà anche dimostrare l'iniezione diretta nel citoplasma cellulare. Microiniezione diretta nella cella è più robusto, ma in termini di tempo l'orientamento corretto embrione e la tecnica microiniezione è richiesto. Come la membrana cellulare è più rigoroso rispetto della membrana tuorlo, è spesso più veloce per entrare nel micropipetta attraverso il tuorlo per raggiungere il citoplasma della cellula. Orientando il polo animale verso il fondo della vasca e di lavoro con mano ferma può aiutare in questo metodo di iniezione.
- Dopo la microiniezione, luogo gli embrioni in una capsula di Petri con media E3 e incubare loro a 28,5 ° C per il normale sviluppo.
- Nelle prossime ore e giorni diversi dello sviluppo embrionale, osservare gli embrioni per la fenotipi di interesse.
Parte 8: I risultati rappresentativi
EGFP mRNA iperespressione: Per verificare il successo della microiniezione, che monitorerà l'espressione della GFP in embrioni di sviluppo a partire fase scudo (~ 6 HPF) dal vivo in tutto-embrione microscopia a fluorescenza (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Espressione del costrutto è più forte durante gli eventi precoci dello sviluppo embrionale e spesso diminuiscono nel corso dello sviluppo come l'iniezione di RNA è ricoperto a poco a poco degradato e dipende dalla stabilità della proteina espressa.
PKD2 traslazionale-blocking morfolino: Sulla base dei risultati precedentemente pubblicato, ci aspettiamo che il PKD2 morphants per imitare la curvatura dorsale asse del corpo come si trova nel PKD2 zebrafish mutanti e cisti renali presenti a circa 2-3 dpf 4.
Figura 1: i risultati Rappresentante microiniezione di mRNA EGFP e PKD2 agosto morfolino. (A) gli embrioni sono stati TAB microiniettati a 1-cellula palco con 0,17 ng di mRNA EGFP e visualizzati a 1 dpf per l'espressione in vivo GFP. (B, c) gli embrioni sono stati TAB microiniettati a 1-cellula palco con ~ 1.7 nl di un PKD2 traslazionale morfolino blocco a 0,50 mm e ha segnato per la curvatura dorsale del corpo a 4 dpf.
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Discussion
Microiniezione in embrioni di zebrafish è una tecnica consolidata e robusta per esplorare il ruolo di un particolare gene nello sviluppo. Le applicazioni includono l'iperespressione, misexpression e saggi knockdown del gene di interesse così come l'analisi epistatico fra più geni. Microiniezione in zebrafish è stato ampiamente utilizzato per la generazione di animali transgenici, e mappatura destino delle cellule ai primi embrioni blastula 5,6,7,8,9. Inoltre, l'applicazione di questa tecnica serve come tappa fondamentale nella generazione della linea germinale chimere con metodi trapianto di cellule 10.
Un metodo alternativo per visitare fenotipo di un gene 'guadagno di funzione' è quella di microinject forme costitutivamente attiva di quel gene. Inoltre, 'la perdita di funzione' pseudo-fenotipo di un gene può essere esplorato da microiniezione di forme dominanti negative di quel gene. Microiniezione in embrioni di zebrafish può includere anche il DNA e piccole molecole 11,12.
Un passo fondamentale in questa tecnica microiniezione è la qualità dell'ago micropipetta. Noi facciamo il nostro micropipetta da tubi capillari plasmato da un dispositivo estrattore pipetta. E 'essenziale che l'estrattore pipetta sia ben calibrato per produrre la forma ottimale ago e dimensioni. Micropipette che sono troppo lunghe e strette spesso rigidità mancanza, si rompono facilmente e fatica a penetrare il corion e tuorlo. Micropipette brevi sono spesso più inclini a danneggiare l'embrione durante la microiniezione.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal NIH e PKD fondazione a ZS. Tutti gli esperimenti sugli animali sono state condotte in base a Yale Animal Resources Center (Yarc) e cura degli animali istituzionali e Usa Committee (IACUC) le linee guida.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
- Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
- Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
- Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
- Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
- Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
- Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
- Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
- Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
- Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
- Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).
