ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

Summary

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。

Abstract

開発中に遺伝子の役割を調査するための不可欠なツールには、遺伝子ノックダウン、過剰発現、およびmisexpressionの研究を実行する機能です。ゼブラフィッシュの（

Protocol

パート1：マイクロピペットの準備、およびマイクロインジェクションチャンバープレート

1. 加熱とマイクロピペットプラー装置でホウケイ酸ガラス毛細管（世界プレシジョンインスツルメンツ社、1B100 - 4）を引いて（サッターインスツル株式会社、フレーミング/ブラウンP - 97）でマイクロピペットを作製。粘土や粘着テープの少量の上にペトリ皿に保管してください。
2. 注入中に胚を保持するための簡単な方法（"ゼブラブック"で説明したように）となるくさび形トラフで成形された1 × E3培地プレートに1.5％アガロース（アメリカンBioanlytical、（株）、AB00972 - 00500）を注ぐ^（1）寒天チャンバープレートは4℃で使用してストアする前に固化してみましょう

パート2：RNAの調製

遺伝子機能研究のための一つの強力なアプローチは、ゼブラフィッシュ胚のin vitro転写されたキャップRNA に微量注射することです。キャップRNAは、CAPのアナログの存在のために生体内で見られる真核生物のmRNAと同じように振る舞います。ゼブラフィッシュ研究者が日常的に興味のある遺伝子を過剰発現またはmisexpressにこのメソッドを使用しています。このデモでは、EGFP -タグ付き写しを顕微注入するだろうし、成功した注射のための可視読み出しとしてライブ全体の胚のGFP -式を使用します。

1. 興味のある成績証明書に関する in vitro CAP RNAの転写反応で行います。私たちの研究室では、我々は日常的にpCS2 +ベクターに目的のcDNAを挿入し、mMessage mMachine SP6キット（Ambion社、（株）、AM1340）を用いてキャップRNAの大量の in vitro合成反応で行います。
2. RNeasyミニキット（キアゲン社、74104）を介して実行するか、またはフェノールによるRNAサンプルを浄化：クロロホルム抽出およびイソプロパノール沈殿。
3. 慎重に使用するための準備ができるまで-80℃でRNA調製とストアの濃度を決定する。
4. 注射の日に、RNAサンプルを解凍、軽くボルテックスし、手短にスピンダウン。
5. 0.050パーセントフェノールレッド（シグマ - アルドリッチ社、P0290） - 滅菌水と0.025の最終濃度で希釈標準溶液を準備します。フェノールレッドは、胚への溶液の注入のための可視マーカーとして機能します。この記事では、我々は0.050％フェノールレッドでは100 ng / uLのEGFPのmRNAの希釈標準溶液を準備します。
6. -80℃に氷とリターンRNAの株式の実際のサンプルを続ける
7. ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます。

パート3：モルホリノの準備

モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを広く対象となるタンパク質の翻訳をブロックすることにより、またはpre - mRNAのスプライシング^2,3を変更することによって遺伝子発現を変更するために使用されます。ゼブラフィッシュのモルフォは、遺伝子機能をノックダウンにより、強力な逆遺伝学のツールと​​して機能します。この記事では、PKD2の翻訳開始部位（5' - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3'）をターゲットにモルホリノオリゴを顕微注入するでしょう。以前に確立された作業に基づいて、我々は、注入された胚の表現型PKD2変異魚^4を模倣することを期待しています。

1. 我々は日常的に特にジーンツールから目的の遺伝子、LLC（フィロマス、OR）のために設計されたモルホリノオリゴの300 nmolのを注文。
2. 3mMのストック溶液を作るために100μLの滅菌水を追加。使用直前まで-20℃で分注しソリューションとストア。
3. 注射の日に、65℃モルホリノソリューションを加熱し5分間° C。直ちに氷上で冷却パチンと簡単にスピン。このステップでは、オリゴ内の任意の二次構造を変性し、溶液を完全に可溶化されることが保証されます。
4. 0.050パーセントフェノールレッド - 滅菌水と0.025の最終濃度でモルホリノ溶液を希釈することにより、ワーキング溶液を調製。このデモでは、我々は0.050％フェノールレッドで0.50 mmのPKD2モルホリノのワーキング溶液を調製する。
5. 室温でソリューションを働き続ける。
6. ときにこのサンプルを注入する準備ができてパート4に進みます.----

パート4：正常に機能するソリューションとマイクロピペットを充填

1. 鉗子または50倍の倍率で解剖顕微鏡（ニコンインスツルメンツ社、SM2645）の下に見えるように開口部を作成するために外科的黒人とマイクロピペットの先端チップをカット。
2. カバースリップ上にドロップなどの作業溶液2 ULを置きます。
3. 皮下注射針と少し浸しワーキング溶液がドロップにマイクロピペットの先端チップを上にチューブを装着した5 mLの注射器にマイクロピペットの背面に取り付けます。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。
4. シリンジのプランジャーを引いて、マイクロピペットの先端を通して実用的なソリューションをサイフォン。

パート5：マイクロピペットの注入量のキャリブレーション

1. マイクロメータのスライド上にミネラルオイルを一滴（アメリカンバイオアナリティカル社、AB00921 - 00025）（Fiを置きますシェール、12 - 561 - SM1）。
2. 圧力パルスマイクロインジェクター装置（世界プレシジョンインスツル株式会社、PV830）の電源とエアの供給をオンにします。
3. マイクロインジェクタの装置のマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを取り付けます。マイクロインジェクタは、圧力調節と放電がフットペダルを押すことによって活性化されています。
4. 解剖顕微鏡下で、マイクロメートルの油の上に、作業溶液の液滴を配置するマイクロインジェクターを使用して注入量をテストします。それはオイルの上に球のようにfloatとしてドロップの直径を測定する。
5. 持続時間と慎重に注入してボリュームを校正するために注射の圧力を調整します。このステップでは、マイクロインジェクションの実験の再現性にも役立ちます。このデモでは、すべてのmicroinjectionsは0.15ミリ（体積で約1.76 NL）の液滴直径で行われます。
6. あなたの注入量が校正された後、埋め戻しとマイクロピペットの漏洩を防ぐために、マイクロインジェクターの"ホールド"ノブを使用してください。

第6部：マイクロインジェクションのための準備受精ゼブラフィッシュの胚

1. ゼブラフィッシュは、ランダムに毎朝の最初の数時間でかん合します。 1セルの段階で胚を収集し、1X E3培地に置いてください。
2. 3mLの転送ピペット（ベクトンディッキンソン実験器具、357524）を使用して、マイクロインジェクションチャンバープレートのくさび形の谷に沿って胚を手配する。
3. 胚が浅く水没し、浸水されないようにメディアを取り外します。このステップでは、同様にマイクロピペットで絨毛膜の浸透のように谷の底部に胚の解決に役立ちます。

パート7：絨毛膜を介してマイクロインジェクション

1. 1細胞期胚の細胞質は解剖顕微鏡下で見えるようにマイクロピペットで胚を操作する。マイクロピペットの先端を破損しないように注意してください。
2. 胚に注入するために、絨毛膜し、マイクロピペットと卵黄を貫通する。このデモでは、我々はまず最初に、直接セルの下に卵黄にマイクロインジェクションし、細胞内に実用的なソリューションをもたらすために細胞質の流れと拡散を許​​可されます。この流れは、ワーキング溶液に添加し、フェノールレッドによる可視です。
3. 我々はまた、細胞の細胞質に直接注入のデモンストレーションを行います。適切な胚の向きとマイクロインジェクション技術が要求されるようにセルに直接マイクロインジェクションは、より堅牢なだけ時間がかかります。細胞膜は、卵黄の膜よりも厳格であるとして、それは細胞の細胞質に到達するための卵黄を介してマイクロピペットを入力することが多い高速です。トラフの底部に向かって動物極の向きや安定した手での作業は、注入のこの方法で助けることができる。
4. マイクロインジェクションした後、E3培地とシャーレに胚を置いて、28.5でそれらをインキュベート° Cの正常な発達のために。
5. 胚発生の次の数時間、数日にわたって、目的の表現型の胚を観察。

パート8：代表的な結果

EGFPのmRNAの過剰発現：マイクロインジェクションの成功を確認するには、我々 は 、in vivo全胚蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社、MZFLIII） のことでシールドのステージ（〜6 HPF）で始まる胚におけるGFPの発現を監視します。構築物の発現は、胚発生の初期の事象の間に最も強く、注入キャップRNAが徐々に低下し、発現タンパク質の安定性に依存するため、多くの場合、開発中に低下します。

PKD2モルホリノを翻訳ブロッキング： - 3 DPF ⁴以前に公表された結果に基づき、我々は約2でPKD2変異ゼブラフィッシュと現在の腎臓の嚢胞に見られるように背側体軸の曲率を模倣するPKD2 morphantsを期待する。

図1：EGFP mRNAおよびPKD2 AUGモルホリノのマイクロインジェクションから代表的な結果。 （A）TABの胚は、EGFPのmRNAの0.17 ngで、1細胞期にマイクロインジェクションし、in vivoで GFPの発現で 1 DPFで可視化した。 （B、C）TABの胚は0.50 mMでPKD2翻訳ブロッキングモルホリノの約1.7 NLで、1セルの段階でマイクロインジェクションし、4 DPFで背側の体の曲率のためにスコア化した。

Discussion

ゼブラフィッシュ胚に微量注入は開発中の特定の遺伝子の役割を探索するための十分に確立し、堅牢なテクニックです。アプリケーションでは、過剰発現、misexpression、および目的の遺伝子だけでなく、複数の遺伝子間のエピスタシスの解析のノックダウンアッセイが含まれています。ゼブラフィッシュのマイクロインジェクションは広くトランスジェニック動物の生成、および初期の胞胚胚^5,6,7,8,9で細胞の運命をマッピングするために使用されています。さらに、この手法の応用は、細胞移植の方法¹⁰で生殖系列キメラを生成する上で重要なステップとなります。

遺伝子の"機能獲得型"の表現型を探索するための一つの代替方法は、その遺伝子の構成的活性型を顕微注入することです。さらに、遺伝子の擬似"機能喪失"表現型は、その遺伝子のドミナントネガティブ型のマイクロインジェクションによって検討されることがあります。ゼブラフィッシュ胚へのマイクロインジェクションは、DNAや低分子化合物^11,12を含めること^ができます。

このマイクロインジェクション法における重要なステップは、マイクロピペットの針の品質です。我々は、ピペットプラー装置によって形成毛細管から私たちのマイクロピペットを行います。それは、ピペットプラーが適切に最適な針の形状とサイズを得るために校正されていることが不可欠です。多くの場合、不足の剛性が長すぎると狭いマイクロピペットは、簡単に分割し、絨毛膜と卵黄に浸透に苦労しています。短いマイクロピペットは、しばしば微量注入時の胚にダメージを与えるになりやすいです。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
1x E3 Medium	Reagent			5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue
All other materials are listed in the protocol.