Summary
Microinjection은 수정된 zebrafish의 배아에 이물질을 소개하는 잘 설립하고 효과적인 방법입니다. 여기, 우리는 강력한 mRNA의 overexpression을 수행하기위한 microinjection 기술 및 zebrafish에서 morpholino의 oligonucleotide 유전자 최저 연구를 보여줍니다.
Abstract
개발하는 동안 유전자의 역할을 조사하는 필수적인 도구가 유전자 최저, overexpression, 그리고 misexpression 연구를 수행하는 능력입니다. zebrafish에서 (
Protocol
1 부 : micropipettes의 작성, 그리고 microinjection 챔버 플레이트
- 난방 및 micropipette의 끌어당기는 장치 borosilicate 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기, 주식 회사, 1B100 - 4) 당기 (셔터 인 스트 루먼트 주식 회사, 플라밍 / 브라운 P - 97)에 의해 micropipettes를 조작. 점토 또는 접착 테이프의 소량 위에는 배양 접시에 보관하십시오.
- (같은 'Zebrafish 도서 "에서 설명)를 주사하는 동안 태아를 들고위한 쉬운 방법으로 될 것입니다 쐐기 모양의 골짜기로 성형 1X E3 중간 플레이트에서 1.5 % 아가로 오스를 (미국 Bioanlytical, 주식 회사, AB00972 - 00500) 부어 1. 한천 챔버 플레이트 4 º C.에서 사용하고 저장하기 전에 응고하자
2 부 : RNA의 준비
유전자 기능 연구에 대한 하나의 강력한 접근 방식은 zebrafish 배아의 체외 베꼈는데 덮인 RNA에 microinject하는 것입니다. 뒤덮힌 RNA는 CAP 아날로그의 존재에 의한 생체내에있는 진핵세포 mRNAs와 비슷하게 동작합니다. Zebrafish 연구자들은 일상적으로 관심이 자신의 유전자를 overexpress 또는 misexpress이 방법을 활용합니다. 이 예제에서 우리는 EGFP - 태그 사본을 microinject하고 성공적인 주사에 대한 눈에 띄는 판독으로 살고 전체 - 배아 GFP 표현을 사용합니다.
- 관심의 사본에 체외 CAP RNA의 전사 반응을 수행합니다. 우리가 실험실에서, 우리는 정기적으로 pCS2 + 벡터에 관심이 cDNA를 삽입하고 mMessage mMachine SP6 키트 (앰비온, 주식 회사, AM1340)를 사용 덮인 RNA의 대량의 체외 합성 반응을 수행합니다.
- RNeasy 미니 키트 (Qiagen, 주식, 74104)를 통해 그것을 실행하거나 페놀에 의해 RNA 샘플을 정화 : 클로로포름 추출 및 이소프로판올 석출합니다.
- 신중하게 사용하기 위해 준비까지 -80 º C에서 RNA의 준비와 저장소의 농도를 결정합니다.
- 주사 당일, 가볍게 RNA 샘플, 소용돌이를 해동하고 간단히 스핀 다운.
- 0.050 % 페놀 레드 (시그마 - 알드리치 (주), P0290) - 살균 물, 0.025의 최종 농도와 함께 작동하는 솔루션을 준비합니다. 페놀 레드는 배아로 솔루션의 주입에 대한 눈에 띄는 표지 역할을합니다. 이 문서에서는, 우리는 0.050 % 페놀 레드 100 NG / UL EGFP의 mRNA의 작업 솔루션을 준비합니다.
- -80 ° C.에 얼음과 반환 RNA 재고 작업 샘플을 보관
- 경우이 샘플을 주입 준비 4 부로 진행합니다.
파트 3 : morpholino의 작성
Morpholino 안티 센스 oligonucleotides 널리 타겟 단백질의 번역을 차단하거나 사전 mRNA의 splicing 2,3를 수정하여 유전자 발현을 수정하는 데 사용됩니다. zebrafish에 Morpholinos는 유전자 기능을 쓰러뜨린하여 강력한 반대 유전학의 도구로 제공하고 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 pkd2의 translational 개시 사이트 (5' - AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC - 3 ')를 타겟으로하는 morpholino oligo를 microinject 것입니다. 이전에 설립 작업을 바탕으로, 우리는 주입된 배아가 phenotypically pkd2 돌연변이 물고기 4 모방 것으로 기대합니다.
- 우리는 일상적으로 특별히 진 도구에서 관심의 유전자, LLC (필로 매스, OR)을위한 morpholino oligo 300 nmol 주문.
- 3 MM 주식 솔루션을 100 UL 멸균 물을 추가합니다. 사용을위한 준비까지 -20 ° C에서 나누어지는 솔루션 및 저장합니다.
- 주사 당일, 65에서 morpholino 솔루션을 열 5 분 ° C. 즉시 얼음에 냉각 스냅 그리고 짧게 스핀. 이 단계는 oligo에 보조 구조 denatures 및 솔루션 완전히 solubilized 것을 보장합니다.
- 0.050 % 페놀 레드 - 살균 물, 0.025의 최종 농도에 morpholino 솔루션을 diluting에 의해 작동하는 솔루션을 준비합니다. 이 예제에서, 우리는 0.050 % 페놀 레드와 0.50 MM pkd2 morpholino의 작업 솔루션을 준비할 것이다.
- 실온에서 솔루션을 계속해.
- 경우이 샘플을 주입 준비 4 부로 진행합니다 .----
4 부 : 귀하의 작업 솔루션 micropipette를 필링
- 포셉와 micropipette의 말초 팁 또는 50X 배율에서 해부 현미경 (니콘 인스 트루먼 트 주식 회사, SM2645)의 단지 보이는 개방을 만드는 수술 razorblade 컷.
- coverslip에 드롭으로 작업 솔루션의 플레이스 2 UL.
- 피하 주사 바늘과 약간 잠수함 작업 솔루션의 드롭에 micropipette의 말초 팁을에 튜브가 장착되어 5 ML의 주사기에 micropipette의 뒷면을 연결합니다. micropipette의 팁을 휴식 않도록주의를 가져가라.
- 주사기의 플런저를 당기는하여 micropipette의 말초 끝에 통해 작업 솔루션을 사이픈.
5 부 : micropipette 사출 볼륨을 눈금 보정
- 마이크로 미터 슬라이드에 광유의 드롭 (미국 Bioanalytical, 주식 회사, AB00921 - 00025) (FI를 배치쉐어, 12-561 - SM1).
- 압력 펄스 마이크로 연료 분사 장치 (세계 정밀 계측기 주식 회사, PV830)에 전원 및 공기 공급을 켜십시오.
- 마이크로 연료 분사 장치의 micropipette 홀더에 micropipette을 첨부합니다. 마이크로 연료 분사 압력과 배출 규제가 발 페달을 눌러 활성화됩니다있다.
- 해부 현미경 아래에서 마이크로 미터 기름에 귀하의 작업 솔루션의 한 방울을 배치하기 위해 마이크로 인젝터를 사용하여 사출 볼륨을 테스트합니다. 그것은 기름 위에 구형의 수레로 드롭의 직경을 측정합니다.
- 기간 및 신중하게 분사의 볼륨을 조정하기 위해 사출 압력을 조정합니다. 이 단계는 microinjection 실험의 재현성에 에이즈. 이 예제에서는 모든 microinjections은 0.15 mm (볼륨에서 약 1.76 NL)의 드롭 직경 할 것입니다.
- 주사 볼륨이 보정되면 backfilling 및 micropipette의 누출을 방지하기 위해 마이크로 인젝터에있는 "대기"노브를 사용합니다.
6 부 : microinjection에 대비하여 수정된 zebrafish의 배아
- Zebrafish는 무작위로 매일 아침의 처음 몇 시간 짝짓기합니다. 1 세포 단계에서 배아를 수집하고 1X E3 미디어에서 그들을 놓으십시오.
- 3 ML 전송 pipet (백톤 디킨슨 Labware, 357,524)를 사용하여 microinjection 챔버 플레이트에 쐐기 모양의 골짜기를 따라 배아를 준비.
- 배아가 shallowly 잠수과 침수되지 않도록 매체를 제거합니다. 이 단계는 아니라 micropipette하여 chorion의 침투에로 골짜기의 바닥에 배아를 정착 에이즈.
7 부 : chorion 통해 Microinjection
- 1 세포 단계의 배아의 세포질은 해부 현미경으로 볼 수 있도록 micropipette으로 배아를 조작. micropipette의 팁을 휴식 않도록주의를 가져가라.
- 배아에 주입하기 위해 micropipette와 chorion 노른자를 침투. 이 예제에서, 우리는 먼저 직접 셀에 아래의 노른자에 microinjecting 수 있으며, 세포로 작업 솔루션을 제공할 수 세포질 유동 및 확산을 수 있습니다. 이 흐름은 작업 솔루션에 추가 페놀 레드로 인해 볼 수 있습니다.
- 우리는 또한 세포 세포질에 직접 주입을 설명합니다. 셀에 직접 microinjection 더 강력한하지만 적절한 배아 오리 엔테이션과 microinjection 기술이 필요합니다 같은 시간 소모됩니다. 세포막은 노른자 막보다 엄격한이기 때문에, 그것은 세포 세포질에 도달 노른자를 통해 micropipette를 입력하는 것이 빠르다. 여물 하단으로 동물 극을 Orienting하고 지속적인 손으로 작업하는 것은 주입이 방법에 도움이됩니다.
- microinjection 후, E3 매체와 페트리 접시에 배아를 장소와 28.5에서 그들을 품어 ° C를 일반 개발.
- 배아 개발의 다음 몇 시간 일 동안 관심의 phenotypes에 대한 배아를 관찰합니다.
8 부 : 대표 결과
EGFP의 mRNA의 overexpression : microinjection의 성공을 확인하려면, 우리는 (Leica 마이크로 GmbH를, MZFLIII) 생체내 전체 - 배아 형광 현미경에 의해 보호막 단계 (~ 6 HPF)에서 시작 개발 배아에서 GFP의 표현을 모니터링합니다. 구조 표현 배아 발달의 초기 이벤트 기간 동안 가장 강력한이며 주입 뒤덮힌 RNA가 점진적으로 저하되고 표현 단백질의 안정성에 따라 자주 개발하는 동안 감소됩니다.
pkd2 translational 차단 morpholino : 이전에 게시된 결과를 바탕으로, 우리가 pkd2 morphants과 같이 약 2 pkd2 돌연변이 zebrafish와 현재 신장 cysts에있는 등 지느러미 본문 축 곡률 모방 기대 - 3 DPF 4.
그림 1 : EGFP의 mRNA와 pkd2 AUG morpholino의 microinjection에서 대표 발생합니다. (A) 탭 배아는 EGFP mRNA의 0.17 NG와 1 세포 단계에서 microinjected 및 생체내 GFP 발현에 1 DPF에 시각되었습니다. (B, C) 탭 배아는 0.50 밀리미터에서 pkd2 translational 차단 morpholino의 ~ 1.7 NL과 1 세포 단계에서 microinjected 4 DPF에서 지느러미 신체 곡률에 대한 채점했다.
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Discussion
zebrafish 배아에 Microinjection 개발에서 특정 유전자의 역할을 탐험 잘 설립하고 강력한 기술입니다. 응용 프로그램 overexpression, misexpression와 관심뿐만 아니라 여러 유전자 간의 epistatic 분석의 유전자의 최저의 assays를 포함합니다. zebrafish의 Microinjection은 널리 유전자 변형 동물을 생성하고, 초기 배아 blastula 5,6,7,8,9의 세포 운명을 매핑에 사용되고 있습니다. 또한,이 기법의 응용 프로그램은 세포 이식 방법 10 세균 온라인 chimeras을 생성의 주요 단계로 제공하고 있습니다.
유전자의 '이득의 기능을'표현형을 탐험에 대한 하나의 대안 방법은 유전자의 constitutively 적극적인 양식을 microinject하는 것입니다. 또한, 유전자의 의사 '손실 함수'표현형은 그 유전자의 지배 부정적인 형태의 microinjection에 의해 살펴 수 있습니다. zebrafish 배아에 Microinjection은 또한 DNA와 작은 분자 11,12을 포함할 수 있습니다.
이 microinjection 기술에서 중요한 단계는 micropipette 바늘의 품질입니다. 우리는 피펫 끌어당기는 장치에 의해 모양의 모세관 튜브에서 우리 micropipette합니다. 그것은 피펫 끌어당기는 제대로 최적의 바늘 모양과 크기를 얻을하도록 조정되어 중요합니다. 너무 오래 그리고 자주 부족 강성 좁고 Micropipettes는 쉽게 휴식과 chorion와 노른자를 침투하는 투쟁. 짧은 micropipettes는 종종 microinjection 동안 배아를 손상 더 쉽습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 ZS에 NIH와 PKD 기초에 의해 지원되었다. 모든 동물 실험은 예일 동물 자원 센터 (YARC) 및 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 지침에 따라 실시되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
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