Summary
Microinyección es un método bien establecido y eficaz para la introducción de sustancias extrañas en embriones de pez cebra fecundado. Este sentido, demuestran una sólida técnica de microinyección para la realización de la sobreexpresión de ARNm, y morpholino oligonucleótidos estudios caída de genes en el pez cebra.
Abstract
Una herramienta esencial para investigar el papel de un gen durante el desarrollo es la capacidad de realizar caída del gen, la sobreexpresión y estudios misexpression. En el pez cebra (
Protocol
Parte 1: Preparación de pipetas y placas de microinyección de cámara
- Fabricar micropipetas de calefacción y tirar los tubos capilares de vidrio de borosilicato (World Precision Instruments, Inc., 1B100-4) en un dispositivo extractor de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown P-97). Almacenar en una placa de Petri en la parte superior de la pequeña cantidad de arcilla o cinta adhesiva.
- Vierta el 1,5% de agarosa (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00500) en placas de medio 1x E3 moldeado con forma de cuña canales que sirven como un método fácil para la celebración de los embriones durante la inyección (como se describe en 'El libro de pez cebra ") 1. Deje que la cámara de placas de agar se solidifique antes de usar y almacenar a 4 º C.
Parte 2: Preparación de ARN
Un método poderoso para los estudios de la función del gen es microinject in vitro transcritos de ARN tope en embriones de pez cebra. Cubiertas de ARN se comporta de manera similar a los ARNm eucariotas en vivo debido a la presencia del análogo de la PAC. Investigadores del pez cebra rutinariamente utilizan este método para sobreexpresar o misexpress su gen de interés. En esta demostración, vamos a microinject una transcripción EGFP de etiquetado y el uso directo de todo el embrión GFP-expresión como una lectura visible de una inyección de éxito.
- Realizar una reacción de transcripción in vitro de la PAC en su transcripción de ARN de interés. En nuestro laboratorio, de manera rutinaria insertar un cDNA de interés en un vector pCS2 + y llevar a cabo una reacción de síntesis in vitro de grandes cantidades de ARN tope con el mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340).
- Purificar la muestra de ARN mediante la ejecución a través de la RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74104) o con fenol: cloroformo extracción y precipitación con isopropanol.
- Con cuidado, determinar la concentración de la preparación de ARN y almacenar a -80 º C hasta que esté listo para su uso.
- En el día de la inyección, descongelar la muestra de ARN, vortex ligeramente y girar hacia abajo brevemente.
- Prepare una solución de trabajo con agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol (Sigma-Aldrich Co., P0290). Rojo fenol sirve como un marcador visible para la inyección de la solución en el embrión. En este artículo, vamos a preparar una solución de trabajo de 100 ARNm EGFP ng / uL con 0,050% de rojo fenol.
- Mantenga la muestra de trabajo en el hielo y acciones retorno de ARN a -80 ° C.
- Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra.
Parte 3: Preparación de morfolino
Morfolino oligonucleótidos antisentido son ampliamente utilizados para modificar la expresión de genes mediante el bloqueo de la traducción de una proteína específica o mediante la modificación de pre-mRNA de empalme 2,3. Morfolinos en el pez cebra servir como una poderosa herramienta genética inversa por derribar la función del gen. En este artículo vamos a microinject un oligo morfolino dirigidos al sitio de iniciación de la traducción de PKD2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3 '). Basado en el trabajo previamente establecido, se espera que los embriones inyectados para imitar fenotípicamente PKD2 4 peces mutantes.
- En forma rutinaria para 300 nmol de un oligo morfolinos diseñado específicamente para un gen de interés por parte de Gene Herramientas, LLC (Philomath, OR).
- Añadir 100 uL de agua estéril para obtener una solución 3 mM de valores. Alícuota de la solución y almacenar a -20 ° C hasta que esté listo para su uso.
- En el día de la inyección, calentar la solución morfolino a 65 ° C durante 5 minutos. Ajustar enfriar en hielo inmediatamente y girar brevemente. Este paso desnaturaliza las estructuras secundarias en el oligo y asegura que la solución esté completamente solubilizados.
- Prepare una solución de trabajo mediante la dilución de la solución morfolino en agua estéril y una concentración final de 0,025 a 0,050% de rojo fenol. En esta demostración, que se prepara una solución de trabajo de 0,50 mm PKD2 morfolino con 0,050% de rojo fenol.
- Seguir trabajando solución a temperatura ambiente.
- Proceder a la parte 4 cuando esté listo para inyectar la muestra .----
Parte 4: Llenado de la micropipeta con su solución de trabajo
- Cortar el extremo distal de una micropipeta con fórceps o una hoja de afeitar quirúrgico para crear una abertura que es apenas visible bajo un microscopio de disección (Nikon Instruments, Inc., SM2645) con un aumento de 50X.
- Coloque 2 l de la solución de trabajo como una gota en un portaobjetos.
- Coloque la parte de atrás de una micropipeta a una jeringa de 5 ml equipado con un tubo de una aguja hipodérmica y un poco sumergir la punta distal de la micropipeta en su gota de solución de trabajo. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta.
- Sifón de la solución de trabajo a través del extremo distal de la micropipeta, tirando del émbolo de la jeringa.
Parte 5: Calibración del volumen de inyección micropipeta
- Coloque una gota de aceite mineral (American Inc. Bioanalytical, AB00921-00025) en una diapositiva micrómetro (Fisher, 12-561-SM1).
- A su vez en el poder y el suministro de aire a la presión de pulso micro inyectores aparato (World Precision Instruments Inc., PV830).
- Fije la micropipeta al titular de la micropipeta de los aparatos de micro inyectores. El inyector de micro es la presión regulada y las descargas se activan pulsando el pedal.
- Bajo el microscopio de disección, prueba el volumen de inyección con inyector micro para colocar una gota de la solución de trabajo sobre el aceite de micrómetro. Mida el diámetro de la gota que flota como una esfera en la parte superior del aceite.
- Ajustar la duración y la presión de inyección para calibrar su cuidado volumen de inyección. Este paso ayuda a la reproducibilidad de los experimentos de microinyección. En esta demostración, todas las microinyecciones se llevará a cabo con un diámetro de la gota de 0,15 mm (aproximadamente 1,76 nL en volumen).
- Una vez que el volumen de la inyección ha sido calibrado, utilice el "Hold" botón en el inyector de micro para evitar que el relleno y las fugas de la micropipeta.
Parte 6: Preparación fecundado embriones de pez cebra para la microinyección
- Pez cebra al azar mate en las primeras horas de cada mañana. Recoger los embriones en la etapa 1 de las células y colocarlas en 1x medio E3.
- Con una pipeta de transferencia de 3 ml (Becton Dickinson Labware, 357524), organizar los embriones a lo largo de los valles en forma de cuña en las placas de microinyección de cámara.
- Eliminar el medio para que los embriones son superficialmente sumergida y no inundadas. Este paso ayuda a la solución de los embriones en el fondo de los valles, así como en la penetración del corion de la micropipeta.
Parte 7: Microinyección a través del corion
- Manipular los embriones con la micropipeta de modo que el citoplasma de las embrión en su fase 1-célula ya es visible bajo el microscopio de disección. Tenga cuidado de no romper la punta de la micropipeta.
- Penetrar en el corion y la yema con la micropipeta con el fin de inyectar en el embrión. En esta demostración, que será la primera microinyección en la yema directamente debajo de la celda, y permitir el flujo citoplásmico y difusión para que la solución de trabajo en la célula. Este flujo es visible debido a la rojo fenol a la solución de trabajo.
- También vamos a demostrar de inyección directa en el citoplasma celular. Microinyección directa en la célula es más robusto, pero mucho tiempo como la orientación adecuada del embrión y la técnica de microinyección es necesario. Como la membrana celular es más riguroso que la membrana de la yema, a menudo es más rápido para entrar en la micropipeta a través de la yema de huevo para alcanzar el citoplasma de la célula. Orientar el polo animal hacia la parte inferior de la cubeta y el trabajo con mano firme puede ayudar en este método de la inyección.
- Después de la microinyección, colocar los embriones en una placa de Petri con medio E3 y se incuba en los 28,5 ° C para el desarrollo normal.
- Durante las próximas horas y días diferentes del desarrollo del embrión, observar los embriones para su fenotipos de interés.
Parte 8: Los resultados representativos
EGFP sobreexpresión de ARNm: Para verificar el éxito de la microinyección, vamos a observar la expresión de GFP en los embriones en desarrollo a partir de la etapa escudo (~ 6 HPF) de la microscopia de fluorescencia in vivo de todo el embrión (Leica Microsystems GmbH, MZFLIII). Expresión de la construcción es el más fuerte durante los primeros eventos del desarrollo embrionario y, a menudo disminuirá durante el desarrollo como la inyección de ARN tope es degradado gradualmente y depende de la estabilidad de la proteína expresada.
PKD2 traslación de bloqueo morfolino: En base a los resultados publicados anteriormente, esperamos que el PKD2 morphants para imitar la curvatura del cuerpo del eje dorsal que se encuentra en PKD2 pez cebra mutante y quistes del riñón en la actualidad aproximadamente 2 - 3 fdd 4.
Figura 1: Los resultados representativos de la microinyección de ARNm EGFP y PKD2 agosto morfolino. (A) los embriones fueron TAB microinyección en la etapa de una célula con 0,17 ng de ARNm EGFP y se visualizan en un DPF en vivo la expresión de GFP. (B, c) los embriones fueron TAB microinyección en la fase 1 de las células con ~ 1,7 nl de una PKD2 traslacional bloqueo morfolino a 0,50 mm y anotó para la curvatura dorsal del cuerpo a las 4 de fdd.
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Discussion
Microinyección en embriones de pez cebra es una técnica bien establecida y robusta para explorar el papel de un gen en particular en el desarrollo. Las aplicaciones incluyen la sobre-expresión, misexpression, y los ensayos de caída de su gen de interés, así como el análisis de epistasis entre múltiples genes. Microinyección en el pez cebra ha sido ampliamente utilizado para la generación de animales transgénicos y la asignación de destino de las células de los embriones tempranos de blástula 5,6,7,8,9. Además, la aplicación de esta técnica sirve como un paso clave en la generación de la línea germinal quimeras de los métodos de trasplante de células 10.
Un método alternativo para explorar el fenotipo de un gen "ganancia de función 'es microinject forma constitutivamente activa de ese gen. Además, pseudo un gen "pérdida de la función de" fenotipo puede ser explorado por la microinyección de dominantes negativos de ese gen. Microinyección en embriones de pez cebra también puede incluir el ADN y las moléculas pequeñas 11,12.
Un paso crítico en la técnica de microinyección es la calidad de la aguja micropipeta. Hacemos nuestra micropipeta de tubos capilares en forma de un dispositivo extractor de la pipeta. Es esencial que el extractor de la pipeta está correctamente calibrado para obtener la forma óptima de la aguja y el tamaño. Micropipetas que son demasiado largas y estrechas a menudo carecen de rigidez, se rompen con facilidad y la lucha para penetrar en el corion y la yema. Micropipetas corta a menudo son más propensos a daños en el embrión durante la microinyección.
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Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH y la fundación PKD de ZS. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con Yale Centro de Recursos Animales (YARC) y Atención Institucional para las directrices del Comité (IACUC).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x E3 Medium | Reagent | 5 mM NaCl 0.17 mM KCl 0.33 mM CaCl2 0.33 mM MgSO2 0.1% Methylene blue |
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| All other materials are listed in the protocol. | ||||
References
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