Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Mikroinjektion av mRNA och Morpholino oligonukleotider Antisens i Zebrafish embryon.

Published: May 7, 2009 doi: 10.3791/1113

Summary

Mikroinjektion är en väletablerad och effektiv metod för att införa främmande ämnen i befruktade zebrafisk embryon. Här visar vi ett robust mikroinjektion teknik för att utföra mRNA överuttryck och morpholino oligonukleotid genen studier knockdown i zebrafisk.

Abstract

Ett viktigt verktyg för att undersöka rollen av en gen under utvecklingen är förmågan att utföra gen ÖVERVÄLDIGANDE, överuttryck, och studier misexpression. I zebrafisk (

Protocol

Del 1: Förberedelse av mikropipetter och mikroinjektion tallrikar kammare

  1. Tillverka mikropipetter genom uppvärmning och dra borosilikatglas kapillärrör (World precisionsinstrument, Inc., 1B100-4) i en mikropipett avdragare enhet (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brun P-97). Förvaras i en petriskål på toppen av liten mängd lera eller tejp.
  2. Häll 1,5% agaros (American Bioanlytical, Inc., AB00972-00.500) i 1x E3 medelstora plattor gjutna med kilformade tråg som ska fungera som en enkel metod för att hålla embryon under injektionen (som beskrivs i "The Zebrafish boken") 1. Låt agar kammaren plattorna stelna före användning och förvara vid 4 º C.

Del 2: Förberedelse av RNA

En kraftfull metod för studier geners funktion är att microinject in vitro-transkriberat tak RNA i zebrafisk embryon. Capped RNA uppför sig på samma sätt som eukaryot mRNA finns in vivo på grund av närvaron av den gemensamma jordbrukspolitiken analog. Zebrafisk forskare använder rutinmässigt denna metod för att överuttrycker eller misexpress sina gener av intresse. I denna demonstration kommer vi microinject en EGFP-märkta utskrift och använd bor hel-embryo GFP-uttryck som en synlig avläsning för en lyckad injektion.

  1. Utför en in vitro-CAP RNA transkription reaktion på din utskrift av intresse. I vårt labb, sätter vi rutinmässigt ett cDNA av intresse i en pCS2 + vektor och utföra en in vitro-syntes reaktion av stora mängder av det utjämnade RNA använda mMessage mMachine SP6 kit (Ambion, Inc., AM1340).
  2. Rena RNA-prov genom att köra den genom RNeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., 74.104) eller med fenol: kloroform utvinning och isopropanol nederbörd.
  3. Försiktigt bestämma koncentrationen av RNA preparatet och förvara vid -80 ° C tills redo att användas.
  4. På dagen för injektionen, tina RNA prov, virvel lätt och spinn ner en kort stund.
  5. Bered en brukslösning med sterilt vatten och en slutlig koncentration av 0,025 till 0,050% fenolrött (Sigma-Aldrich Co, P0290). Fenolrött fungerar som en synlig markering för injektion av lösningen i embryot. I denna artikel kommer vi att förbereda en fungerande lösning på 100 ng / UL EGFP mRNA med 0,050% fenolrött.
  6. Fortsätta arbeta prov på is och återgå RNA lager till -80 ° C.
  7. Gå vidare till del 4 när den är klar att injicera detta prov.

Del 3: Beredning av morpholino

Morpholino antisense oligonukleotider används ofta för att ändra genuttryck genom att blockera översättning av en riktad protein eller genom att ändra pre-mRNA splitsning 2,3. Morpholinos i zebrafisk fungera som ett kraftfullt omvänd genetik verktyget genom att knacka ner geners funktion. I denna artikel kommer vi att microinject en morpholino oligo riktade till translationell inleda platsen pkd2 (5'-AGGACGAACGCGACTGGAGCTCATC-3). Baserat på tidigare fastställda arbete räknar vi med den injicerade embryona till fenotypiskt efterlikna pkd2 mutant fisk 4.

  1. Vi beställer rutinmässigt 300 nmol en morpholino oligo särskilt utformad för en gen av intresse från Gene Tools, LLC (Philomath, OR).
  2. Tillsätt 100 uL sterilt vatten för att göra en 3-lösning mM lager. Alikvotera lösningen och förvara vid -20 ° C tills produkten ska användas.
  3. På dagen för injektionen, värm morpholino lösning vid 65 ° C i 5 minuter. Snap svalna på isen omedelbart och spin kort. Detta steg denaturerar eventuella sekundära strukturer i oligo och säkerställer att lösningen är helt solubilized.
  4. Förbered en fungerande lösning genom att späda morpholino lösning i sterilt vatten och en slutlig koncentration av 0,025 till 0,050% fenolrött. I denna demonstration kommer vi att förbereda en fungerande lösning av 0,50 mm pkd2 morpholino med 0,050% fenolrött.
  5. Håll fungerande lösning vid rumstemperatur.
  6. Gå vidare till del 4 när den är klar att injicera detta urval .----

Del 4: Fyllning av mikropipett med din arbetslösning

  1. Skär den distala spetsen av en mikropipett med pincett eller ett kirurgiskt rakblad för att skapa en öppning som bara är synliga i en dissekera mikroskop (Nikon Instruments, Inc., SM2645) på 50X förstoring.
  2. Plats 2 UL av din arbetstid lösningen som en droppe på ett täckglas.
  3. Fäst baksidan av en mikropipett till en 5 ml spruta med slang på en injektionsnål och något dränka den distala spetsen av mikropipett i din droppe fungerande lösning. Se till att inte bryta spetsen av mikropipetten.
  4. Siphon arbetsmiljön lösning genom distala änden av mikropipett genom att dra ut kolven ur sprutan.

Del 5: Kalibrera mikropipetten injektionsvolym

  1. Placera en droppe mineralolja (American Bioanalytiska, Inc., AB00921-00025) på en mikrometer bild (FiSher, 12-561-SM1).
  2. Slå på strömmen och luft till tryck-pulsade mikro insprutare apparater (World precisionsinstrument Inc. PV830).
  3. Fäst mikropipett till mikropipett innehavaren av mikro injektor apparaten. Mikro injektor trycket regleras och utsläpp aktiveras genom att trycka på fotpedalen.
  4. Enligt dissektion mikroskop testa injektionsvolym med hjälp av mikro-injektorn att placera en droppe av din arbetstid lösningen på mikrometer olja. Mät diameter släppa så det flyter som en sfär på toppen av oljan.
  5. Justera längd och tryck injektion att noggrant kalibrera volymen av injektionen. Detta steg stöd i reproducerbarhet mikroinjektion experimentet. I denna demonstration kommer alla microinjections göras med en droppe diameter på 0,15 mm (ca 1,76 NL i volym).
  6. När din injektionsvolymen har kalibrerats, använd "Hold" knappen på mikro-injektorn att förhindra återfyllning och läckage av mikropipetten.

Del 6: Förberedelser befruktade zebrafisk embryon för mikroinjektion

  1. Zebrafisk kommer slumpmässigt parar sig under de första timmarna av varje morgon. Samla embryon vid 1-cell scenen och placera dem i 1x E3 medium.
  2. Med hjälp av en 3 ml överföring pipett (Becton Dickinson Labware, 357.524), ordna embryon längs den kilformade dalar i plattorna mikroinjektion kammaren.
  3. Ta bort mediet så att embryona ytligt är nedsänkt och inte översvämmas. Detta steg hjälpmedel för att lösa de embryon som botten av tråg samt i penetration av chorion av mikropipetten.

Del 7: mikroinjektion genom chorion

  1. Manipulera embryon med mikropipett så att cytoplasman av 1-cell skede embryot syns under dissekera mikroskop. Se till att inte bryta spetsen av mikropipetten.
  2. Penetrera chorion och sedan äggulan med mikropipett för att injicera in i embryot. I denna demonstration kommer vi att vara först microinjecting i äggulan direkt under cellen, och låta cytoplasmiska flöde och diffusion för att få arbeta lösningen i cellen. Detta flöde är synlig på grund av fenolrött lagts till i brukslösning.
  3. Vi kommer också att visa direkt injektion i cellens cytoplasma. Direkt mikroinjektion i cellen är mer robust men tidskrävande som rätt embryo läggning och mikroinjektion teknik krävs. Eftersom cellmembranet är strängare än äggulan membranet, är det ofta snabbare att komma in i mikropipett genom äggulan att nå cellens cytoplasma. Orientera djuret stången mot botten av tråget och arbeta med stadiga händer får stöd i denna metod för injektion.
  4. Efter mikroinjektion, placera embryon i en petriskål med E3-medium och inkubera dem vid 28,5 ° C för normal utveckling.
  5. Över de nästa flera timmar och dagar av fosterutvecklingen, observera embryon för ditt fenotyper av intresse.

Del 8: representativa resultat

EGFP mRNA överuttryck: För att verifiera framgångarna med mikroinjektion, kommer vi att kontrollera uttrycket av GFP i utvecklingsländerna embryon början på skölden skede (~ 6 HPF) av in vivo hel-embryo fluorescensmikroskopi (Leica Microsystems Gmbh, MZFLIII). Redovisning av konstruktion är mest stark under de tidiga händelserna i embryonal utveckling och kommer ofta minskar under utveckling som den injicerade utjämnade RNA gradvis försämras och beror på stabiliteten i det uttryckta proteinet.

pkd2 translationella-blockerande morpholino: Baserat på tidigare publicerade resultat, vi förväntar oss att pkd2 morphants att efterlikna ryggens krökning kroppen axel som finns i pkd2 mutant zebrafisk och presentera cystor njure till en 2 - 3 DPF 4.

Figur 1
Figur 1: Representativa resultat från mikroinjektion av EGFP mRNA och pkd2 augusti morpholino. (A) TAB embryon har idag injiceras vid 1-cell steg med 0,17 ng EGFP mRNA och visualiseras på ett DPF för in vivo GFP uttryck. (B, c) TAB embryon har idag injiceras vid 1-cell scen med ~ 1,7 nl i en pkd2 translationell blockera morpholino på 0,50 mm och gjorde för ryggens kroppen krökning vid 4 DPF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroinjektion i zebrafisk embryon är en väl etablerad och robust teknik för att utforska rollen av en viss gen i utvecklingen. Applikationer inkluderar överuttryck, misexpression och analyser ÖVERVÄLDIGANDE av dina gener av intresse samt epistatisk analys mellan flera gener. Mikroinjektion i zebrafisk har i stor utsträckning använts för att generera transgena djur, och kartlägga cell öde i början blastula embryon 5,6,7,8,9. Dessutom fungerar tillämpningen av denna teknik som ett viktigt steg i att skapa könsstamceller chimärer med metoder celltransplantation 10.

En alternativ metod för att upptäcka en gen som är "gain-of-funktionen" fenotyp är att microinject konstitutivt aktiv form av att genen. Dessutom kan en gen är pseudo "förlust-av-funktionen" fenotyp utforskas genom mikroinjektion av dominerande negativa former av denna gen. Mikroinjektion i zebrafisk embryon kan också innehålla DNA och små molekyler 11,12.

Ett kritiskt steg i denna mikroinjektion teknik är kvaliteten på mikropipetten nålen. Vi gör våra mikropipett från kapillärrör formad av en pipett avdragare enhet. Det är viktigt att pipetten avdragare är korrekt kalibrerad för att ge optimal nål form och storlek. Mikropipetter som är för långa och smala ofta saknar styvhet, går sönder och kämpar för att tränga in i chorion och äggula. Korta mikropipetter är ofta mer benägna att skada embryot under mikroinjektion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Arbetet stöddes av NIH och PKD Foundation för att ZS. Alla djurförsök har utförts enligt Yale Animal Resources Center (YARC) och Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
1x E3 Medium Reagent 5 mM NaCl
0.17 mM KCl
0.33 mM CaCl2
0.33 mM MgSO2
0.1% Methylene blue
All other materials are listed in the protocol.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, University of Oregon. (2000).
  2. Nasevicius, A., Ekker, S. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat Genet. 26, 216-220 (2000).
  3. Draper, B., Morcos, P., Kimmel, C. Inhibition of zebrafish fgf8 pre-mRNA splicing with morpholino oligos: a quantifiable method for gene knockdown. Genesis. 30, 154-156 (2001).
  4. Sun, Z., et al. A genetic screen in zebrafish identifies cilia genes as a principal cause of cystic kidney. Development. 131, 4085-4093 (2004).
  5. Stuart, G., McMurray, J., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103, 403-412 (1988).
  6. Stuart, G., Vielkind, J., McMurray, J., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109, 577-584 (1990).
  7. Culp, P., Nüsslein-Volhard, C., Hopkins, N. High-frequency germ-line transmission of plasmid DNA sequences injected into fertilized zebrafish eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 7953-7957 (1991).
  8. Strehlow, D., Heinrich, G., Gilbert, W. The fates of the blastomeres of the 16-cell zebrafish embryo. Development. 120, 1791-1798 (1994).
  9. Helde, K., Wilson, E., Cretekos, C., Grunwald, D. Contribution of early cells to the fate map of the zebrafish gastrula. Science. 265, 517-520 (1994).
  10. Lin, S., Long, W., Chen, J., Hopkins, N. Production of germ-line chimeras in zebrafish by cell transplants from genetically pigmented to albino embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 4519-4523 (1992).
  11. Long, Q., et al. GATA-1 expression pattern can be recapitulated in living transgenic zebrafish using GFP reporter gene. Development. 124, 4105-4111 (1997).
  12. Murphey, R., Zon, L. Small molecule screening in the zebrafish. Methods. 39, 255-261 (2006).

Tags

Utvecklingsbiologi Zebrafish mikroinjektion morpholino antisense oligonukleotid gen överuttryck gen ÖVERVÄLDIGANDE
Mikroinjektion av mRNA och Morpholino oligonukleotider Antisens i Zebrafish embryon.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, S., Sun, Z. Microinjection ofMore

Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.. J. Vis. Exp. (27), e1113, doi:10.3791/1113 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter