Summary
Это видео показывает, как морфолино или мРНК может быть введен в данио эмбрионов на один-клеточной стадии для уменьшения или увеличения уровня специфических генных продуктов в течение последующего развития.
Abstract
Одним из преимуществ изучения данио является простота и скорость манипуляции белка в зародыше. Morpholinos, которые синтетических олигонуклеотидов с антисмысловых комплементарности целевой РНК, могут быть добавлены в эмбрион сократить выражение того или иного продукта гена. С другой стороны, обрабатываются мРНК могут быть добавлены в эмбрион увеличить уровни генного продукта. Средство для добавления или мРНК или морфолино на эмбрион микроинъекции. Микроинъекция является эффективным и быстрым, позволяя инъекции сотен эмбрионов в час. Это видео показывает все этапы микроинъекции. Короче говоря, яйца собираются сразу после увольнения и выстроились против стекло микроскопа в чашке Петри. Далее, с острым концом иглы загружается с впрыском материала связано с microinjector и источником воздуха и microinjector управления настраиваются для получения желаемого объема инъекции. Наконец, игла погружается в желтке зародыша и морфолино или мРНК изгнаны.
Protocol
Часть 1: производство яиц и сбор
- Ночь перед инъекцией, созданная в разведении рыбы танков с разделителями на месте. Для увеличения общего объема производства яйца, рыба может быть создан в отношения двух женщин к одному мужчине, если это необходимо.
- На следующее утро, после комнате свет включается, тянуть делителей из нескольких танков и позволяют в течение примерно 20 минут спокойно время спаривания.
- Использование фильтра, собирать яйца из садки и ополосните их водой с яйцом. Вылейте яйца в чашке Петри с яйцом водой и удалить неоплодотворенные яйца и мусор с передачей пипетки. Рыба может быть перегруппированы в больших резервуарах для получения дополнительных раундов яйца для инъекций. Отрегулируйте сроки сбора яиц, чтобы обеспечить максимальное число яиц к производству, не давая им пройти одну стадию клетки.
- Место стекло микроскопа в перевернутую крышку 100 мм чашки Петри. Использование передачи пипетки выстроить яйца к стенке слайд формирования одном столбце. Удалите излишки воды яйцо из слайдов, нажав Kimwipe против стороны, противоположной яйца. (Рис. 1А)
Часть 2: игла тянет, погрузка, и подготовка
- С съемник микропипетки, тянуть 1,0 мм стекло OD капилляр в две иглы и хранить в 150 мм чашки Петри, заложив за глупые рампы шпаклевки. Иглы можно вытянуть вперед.
- Backload игла с 3 мкл инъекции материала с помощью пипетки microloader. Встряхните болюсного в сторону кончика иглы, пока Есть мало или совсем нет пузырьков осталось.
- Включите источник воздуха и microinjector. Вставьте иглу в microinjector и обеспечения герметичности внутри корпуса. Убедитесь, что микроманипулятора находится в правильном положении, чтобы обеспечить широкий диапазон движений и корректировки. Принесите иглы в плоскости зрения микроскопа, высокая со сцены, и сосредоточиться на тонкой области кончика. Используйте пару острых щипцов, чтобы отщипывать иглу в точке, которая выходит из иглы достаточно узкими, чтобы проникнуть хориона и желток, но все еще способных доставлять соответствует размер гранул. Капли нефтепродуктов на микрометр может быть использована для расчета объема каждой инъекции. При попадании в масло, шарик с диаметром 0,1 мм содержит 500 ФЛ инъекции материала (рис. 1б); инъекции объемах 500 рь или 1nL обычно используются. Нажмите на педаль и контролировать размер шарик урезая иглы и регулировки давления впрыска по мере необходимости. Идеально объемы инъекций заполнят около 10% объема яйца. Качество иглы имеет решающее значение для обеих легкость впрыска и качество и согласованность результатов.
Часть 3: инъекция
- Обеспечить эмбрионов не разработали прошлого четыре-клеточной стадии. В идеале, эмбрионы должны быть на один-клеточной стадии.
- Опустите иглу в сторону колонки яиц, держа блюдо в месте с противоположной стороны.
- Пирс поверхности хориона и введите желток в одной плавности хода во время просмотра для любого дробления или разрыв желточного мешка. Inject инъекции материала в желтке (рисунок 1С). Избегайте инъекционных пузырьков воздуха или растяжения желтка, как любой из них может быть смертельным для эмбриона. Рабочие вниз линию, отрегулировать давление, необходимое для поддержания последовательного размер гранул и, используя наконечник пипетки удалить яйца, которые выглядят неоплодотворенные или разрушены во время процесса впрыска.
- После завершения колонке яйца, использовать струю воды яйца, чтобы переместить вводят яйца в чистую чашку Петри. При необходимости повторите. Держите несколько uninjected эмбрионов в качестве контроля. В конце первого дня, удалить мертвые эмбрионы и записи количества вводимого эмбрионов. Замените яйцо вода в блюдо периодически, чтобы уменьшить вероятность заражения.
Часть 4: Представитель результаты
В зависимости от того, что вводится, эмбрионы могут выжить по более низкой ставке, чем их uninjected братьев и сестер. К счастью, это легко вводится огромное количество из них, так это редко является проблемой. Это нормально для morphants проявлять небольшая задержка развития.
Для иллюстрации результатов микроинъекции, мы использовали этот протокол для управления уровнем белка Heart Of Glass (HEG). HEG это трансмембранный белок, необходимый для нормального развития сердца. В его отсутствие, эмбрионы развиваться сердца с гигантскими путей притока и камер 1. Мы вводили два не описанных morpholinos против хег, heg_e3i3_egfr1 и heg_e4i4_egfr2, в концентрации 500 мкМ. В 2 дней после оплодотворения, uninjected управления брат кажутся нормальными, как и ожидалось (2А фигурой и B). Эмбрионы вводили heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга (рис. 2С). Хотя сердцах большинства этих morphants изменили морфологии, их камеры, как правило, размером (рис. 2D). Эмбрионы вводилис heg_e4i4_egfr2 выставку переменная пороков сердца. Некоторые выглядят нормальными, а другие имеют большие участки притока и умеренно увеличена предсердий (2E фигура и F). Хег мутант, как сообщалось ранее 1, имеет чрезвычайно увеличены путей притока и предсердия (рис. 2G и H).
Мы также вводили дикого типа эмбрионов с 400 нг / мкл РНК транскрибируется из полнометражных хег кДНК. Хотя uninjected управления развиваются нормально (рис. 3А и В), эмбрионы вводят хег мРНК выставку спектра фенотипов от дикого типа внешности тяжелой циклопии, укорочение главной оси тела, некроз голову и тело, и средняя линия дефектов (рис. 3C и D).
Рисунок 1. Эмбрионы, который будет введен выстроились против стекло микроскопа в чашке Петри (А). Инъекция объем определяется путем введения в минеральное масло размещены на микрометр. Объемом впрыска от 500 PL, который обычно используется, имеет диаметр 0,1 мм (В). Сразу же после инъекции, морфолино или мРНК видна как точечный пятна в желтке (С).
Рисунок 2. В 2 дней после оплодотворения, uninjected эмбрионы не имеют валовой дефектов () или сердечный фенотипа (В). Эмбрионы вводили морфолино heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга (С, стрелка), но, как правило размеров камер сердца (D). Некоторые эмбрионы вводят морфолино heg_e4i4_egfr2 расширили путей притока и предсердий (E, F). хег мутантов серьезно увеличить приток путей и предсердий (G, H). (A), (C), (E) и (G) являются 4x DIC изображений; (Б), (D), (F) и (Н) 20x DIC изображений. атриум =, = это приток тракта.
Рисунок 3. Через 24 часа после оплодотворения, uninjected эмбрионы имеют длинные, прямые тело без некроза или средней линии дефектов () и две четко определенные глаза нервной трубки между ними (B). Некоторые эмбрионы вводят хег мРНК, напротив, обладают укороченной оси тела, некроз, misshaped сомитов (С), и циклопии (D). (А) и (С) 4x DIC изображений; (Б) и (D) имеют 20-кратный DIC изображений.
Discussion
Одной из сильных сторон модели системы данио является легкость, с которой определенные продукты генов могут быть добавлены или исключены из эмбриона путем микроинъекции. Чтобы повсеместно гиперэкспрессией частности белка, мРНК, кодирующей ее закачивают в желтке на 1-клеточной стадии. Во время последующего развития эмбриона, РНК, распространяется по всему организму и переводится. С другой стороны, для устранения того или иного белка, morpholinos используются. Morpholinos синтетические олигонуклеотиды разработан с антисмысловых взаимодополняемости конкретных РНК. Как мРНК, morpholinos вводят желток на 1-клеточной стадии. Внутри эмбриона они связывают свои РНК мишени, предотвращение перевода.
Основные изменения, которые необходимо сделать для каждого морфолино или мРНК концентрации вводимого материала. Слишком высокая концентрация либо морфолино или мРНК может вызвать неспецифические токсичности, в то время как каждый морфолино должно быть проверено эмпирически определить его оптимальную концентрацию, как правило, морфолино концентрациях от 200 мкМ и 500 мкМ сбить активность генов эффективно, не вызывая неспецифические дефекты. Точный размер иглы открытие не является решающим. В диапазоне размеров иглы, давление впрыска и время впрыска может быть отрегулирована для производства болюс правильный объем.
Morpholinos имеют много приложений, в том числе функциональной рассечение доменов в белке. Когда предназначены для решения конкретных экзон-интрон переходы, morpholinos будет препятствовать сращивания от происходящих в нем. Мы исследовали влияние двух morpholinos, которые связывают экзон-интрон переходов в пре-мРНК из хег. Морфолино heg_e3i3_egfr1 связывает стыке экзонов 3 и интрон 3, предотвращения сращивания машины от включения экзона 3 в зрелые транскриптов. Морфолино heg_e4i4_egfr2 так же удаляет экзон 4. Оба экзонов 3 и 4 кодировать доменов, содержащих ЭФР-подобных повторов. Некоторые эмбрионы вводят heg_e4i4_egfr2 умеренно фенокопии мутант, дальнейшие эксперименты будут необходимы для понимания роли HEG экзона 4 в развитии сердца. Удивительно, но эмбрионы вводят heg_e3i3_egfr1 есть отек мозга, функция не видел в хег мутантов. Это может быть связано со способностью связывать morpholinos материнской стенограмм, которые будут затронуты в зиготических мутантов.
Acknowledgments
Мы признаем, члены Мабли лаборатории и Narie Сторера за техническую помощь, а также Американской ассоциации сердца (НКРЗ Ученый грантов на цели развития 0635363N) и Национальный институт сердца, легких и крови институт (грант SCCOR RFA HL02-027) для финансирования.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | MN 153 | |
| Needle Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P 97 | |
| Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100 F6 | |
| Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Needle Holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH310 |
References
- Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).
