Summary
Bu video morfolino veya mRNA sonraki gelişimi sırasında spesifik gen ürünlerinin seviyesini azaltmak veya artırmak için tek hücreli aşamada zebrafish embriyoların nasıl enjekte edilebilir gösterir.
Abstract
Eğitim zebrafish avantajlarından biri embriyo protein düzeyleri manipüle kolaylığı ve hız. Antisens tamamlayıcılık hedef RNA'lar sentetik oligonükleotidlerdir Morpholinos, belirli bir gen ürünü ifade azaltmak için embriyo eklenebilir. Tersine, bir gen ürünü işleme mRNA düzeylerini artırmak için embriyo olabilir. Bir embriyo ya da mRNA veya morfolino eklemek için araç mikroenjeksiyon. Mikroenjeksiyon saatte embriyo yüzlerce enjeksiyon için izin, verimli ve hızlı. Bu video mikroenjeksiyon yer alan tüm adımları gösterir. Kısaca, yumurta atılmaktadır sonra hemen toplanır ve bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı karşı dizilmiş. Daha sonra ince uçlu bir iğne, enjeksiyon malzemesi yüklü bir mikroenjektör ve bir hava kaynağına bağlı olduğu ve mikroenjektör kontrolleri arzu edilen bir enjeksiyon hacmi üretmek için ayarlanabilir. Son olarak, iğne embriyonun yumurta sarısı içine dalmış ve morfolino veya mRNA atılır.
Protocol
Bölüm 1: Yumurta üretim ve toplama
- Enjeksiyon için önceki gece yerde bölücüler ile üreme tankları, balık kurdu. Istenirse toplam yumurta üretimi artırmak için balık, bir erkek iki kadın oranı ayarlanmış olabilir.
- Ertesi sabah, oda ışıkları sonra, açmak birkaç tankları bölücüler çekin ve bozulmamış çiftleşme süresi yaklaşık 20 dakika izin verir.
- Bir süzgeç kullanarak, üreme kafesleri yumurtaları toplamak ve yumurta su ile durulayın. Yumurta, yumurta su ile bir Petri kabı içine dökün ve bir transfer pipeti ile döllenmemiş yumurta ve enkaz kaldırmak. Balık, enjeksiyon için yumurta ilave tur üretmek için büyük tanklarda yeniden bir araya olabilir. Onlara tek bir hücre aşamasına geçmek izin vermeden üretilen yumurta maksimum numaraları için izin yumurta toplama zamanı ayarlayın.
- 100mm bir Petri kabı ters kapağı bir mikroskop lamı yerleştirin. Tek bir sütun oluşturan slayt kenarına yumurta hattına bir transfer pipet kullanın. Yumurta ters tarafına karşı Kimwipe basarak slayt fazla yumurta su çıkarın. (Şekil 1A)
Bölüm 2: İğne yükleme, çekme, ve hazırlık
- Mikropipet çektirmesi ile aptalca macun rampalar üzerinden atarak, 150mm Petri kabındaki iki iğne ve mağaza içine kılcal bir 1.0mm OD cam çekin. İğneler önceden çekilmiş olabilir.
- Microloader pipet kullanarak enjeksiyon malzemesinin 3 mcL Backload iğne. Kalan az veya hiç kabarcık kalmayana dek bolus iğne ucu doğru sallayın.
- Hava kaynağı ve mikroenjektör açın. Mikroenjektör iğne takın ve konut içinde sıkı bir mühür sigorta. Mikromanipülatör geniş bir yelpazede hareket ve uyum sağlamak için uygun bir pozisyonda olup olmadığını kontrol edin. Mikroskop görüş sahneden yüksek düzlem, ve ucu ince bölgeye odaklanmak içine iğne ucu getirin. Iğne delmek koryon ve yumurta sarısı kadar dar ama hala tutarlı bir boncuk boyutu sunma yeteneğine sahip yaprakları bir noktada iğne çimdik, keskin forseps bir çift kullanın. Mikrometre üzerinde mineral yağ Bir damla her enjeksiyon hacmini hesaplamak için kullanılabilir. Yağ enjekte edildiğinde, enjeksiyon malzemesinin 500 0.1 mm çapında bir boncuk pL (Şekil 1B) içerir; 500 pL veya 1nL enjeksiyon birimleri genellikle kullanılır. Ayak pedalına basınız ve iğne kırparak ve gerektiği gibi enjeksiyon basıncı ayarlayarak boncuk büyüklüğündeki LCD ekran. İdeal enjeksiyon hacimleri, yumurta hacminin yaklaşık% 10 dolduracaktır. Iğne ucu kaliteli enjeksiyon kolaylığı ve sonuçların kalite ve tutarlılık çok önemlidir.
Bölüm 3: Enjeksiyon
- Embriyoların dört hücreli aşamasında geçmiş gelişmiş değil. Olun İdeal olarak, embriyolar tek hücreli aşamada olmalıdır.
- Elinin tersiyle çanak tutan, iğne yumurta sütun doğru indirin.
- Pierce yüzey koryon ve yolk kesesi herhangi bir ezilme veya yırtılma izlerken tek bir düzgün bir vuruş sarısı girin. Yumurta sarısı (şekil 1C) içine enjeksiyon malzemesi enjekte edilir. Hava kabarcıkları enjekte ya da embriyo için ölümcül olabilir sarısı germe kaçının. Satır aşağı, bir pipet kullanarak tutarlı bir boncuk büyüklüğü ve sürdürmek için gerekli basınç ayarı, döllenmemiş bir görünüm veya enjeksiyon işlemi sırasında tahrip yumurta çıkarın.
- Yumurta bir sütun tamamladıktan sonra, temiz bir petri kabı içine enjekte edilen yumurta taşımak için yumuşak bir yumurta su akışı kullanın. Gerektiği kadar tekrarlayın. Bir kontrol gibi çeşitli uninjected embriyolar tutun. Gün birinin sonunda, ölü embriyolar kaldırmak ve enjekte edilen embriyoların sayısı kaydedin. Periyodik olarak enfeksiyon olasılığını azaltmak için çanak yumurta su değiştirin.
Bölüm 4: Temsilcilik sonuç
Enjekte ediliyor bağlı olarak, embriyolar kendi uninjected kardeşlerine göre daha düşük bir oranda hayatta kalabilirler. Neyse ki, bunlardan çok sayıda enjekte etmek kolaydır, bu nadiren bir sorun. Morphants biraz gecikmeli gelişim sergilemek için normaldir.
Mikroenjeksiyon sonuçlarını göstermek için, biz, Cam protein Heart (HEG) düzeyleri işlemek için bu protokol kullanılır. HEG normal kalp gelişimi için gerekli bir transmembran proteindir. Onun yokluğunda, embriyolar dev girişi yolları ve odaları 1 kalpleri gelişir. Biz 500 mcM bir konsantrasyonda HEG heg_e3i3_egfr1 ve heg_e4i4_egfr2 karşı daha önce tanımlanmamış iki morpholinos enjekte etti. 2 gün yazılan gübreleme, uninjected kardeş kontrolleri (Şekil 2A ve B) beklenen normal görünür. Heg_e3i3_egfr1 ile enjekte Embriyolar beyin ödemi (Şekil 2C). Bu morphants en kalbini morfolojisi değişmiş olmasına rağmen, kendi odalarına normal büyüklükte (Şekil 2B). Embriyolar enjekteheg_e4i4_egfr2 sergi değişken kalp kusurları. Diğerleri büyük girişinin yolları ve orta derecede genişlemiş kulakçıklar (Şekil 2E ve F), bazıları normal görünür. Önceden 1 rapor HEG mutant, büyük ölçüde genişlemiş içeakımın ve atrium (Şekil 2G ve H).
Ayrıca, tam uzunlukta cDNA HEG transkripsiyonu 400 ng / mcL mRNA wild tip embriyolar enjekte edildi . (Şekil 3A ve B) uninjected kontrolleri normalde geliştirirken, embriyolar ana gövde eksen, baş ve gövde nekrozu, ve orta hat defektleri (Şekil 3C kısaltılması, mRNA fenotiplerinin wild tip görünüm şiddetli Siklopi değişen bir spektrum sergi HEG ile enjekte ve D).
Şekil 1 enjekte edilir. Embriyolar bir Petri kabındaki bir mikroskop lamı (A) karşı dizilmiştir. Enjeksiyon hacmi bir mikrometre yerleştirilen madeni yağ içine enjekte edilerek belirlenir. , Yaygın olarak kullanılan 500 pL, bir enjeksiyon hacmi 0,1 mm (B) bir çapa sahiptir. Hemen enjeksiyondan sonra, morfolino veya mRNA sarısı (C) noktasal bir nokta olarak görünür.
Şekil 2 2 gün yazılan gübreleme, uninjected embriyoların brüt kusurları (A) veya kalp fenotip (B) vardır. Morfolino heg_e3i3_egfr1 enjekte Embriyolar beyin ödemi (C, ok) ama normal boyutlu kalp boşluklarının (D) var. Morfolino heg_e4i4_egfr2 enjekte Bazı embriyolar genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (E, F) var. HEG mutantlar ölçüde genişlemiş girişi yolları ve kulakçıklar (G, H) var. (A), (C), (E) ve (G) 4x DIC görüntüler; (B), (D), (F) ve (H), 20x DIC görüntü. = atrium, = içeakımın.
Şekil 3, 24 saat yazılan gübreleme, embriyolar (B) arasında bir nöral tüp hiçbir nekroz veya orta hat defektleri (A) ve açıkça tanımlanmış iki gözleri ile uzun, düz bir vücuda sahip uninjected. HEG mRNA enjekte Bazı embriyolar, aksine, kısaltılmış bir vücut ekseni, nekroz, misshaped Somitlerin (C) ve siklops (D) sergilerler. (A) ve (C) 4x DIC görüntüler; (B) ve (D) 20x DIC görüntülerdir.
Discussion
Zebrafish modeli sisteminin güçlü yanlarından biri belirli gen ürünleri veya mikroenjeksiyon embriyo elimine edilebilir olan kolaylığı. Yayg belirli bir protein eksprese için mRNA kodlama, 1-hücreli aşamada yumurta sarısı içerisine enjekte edilir. RNA, embriyonun sonraki gelişimi sırasında, organizma boyunca dağıtılan ve tercüme edilmiştir. Tersine, belirli bir proteinin ortadan kaldırmak için, morpholinos kullanılır. Morpholinos, özel RNA'lar antisens tamamlayıcılık tasarlanmış sentetik oligonükleotidlerdir. MRNA'ların gibi, morpholinos 1-hücreli aşamada sarısı içine enjekte edilir. İçinde de embriyo çeviri önlenmesi, hedef RNA'lar bağlanır.
Her morfolino veya mRNA için yapılması gereken ana değişiklik enjekte malzeme konsantrasyonu. Morfolino veya mRNA ya da çok yüksek bir konsantrasyon, non-spesifik bir toksisiteye neden olabilir; her morfolino non-spesifik kusurları neden olmadan etkili bir gen faaliyetlerinde yıkmak optimal konsantrasyonu, genellikle, 200 mcM ve 500 mcM arasında morfolino konsantrasyonları belirlemek için deneysel olarak test edilmelidir. Iğne açılması kesin büyüklüğü önemli değildir. Iğnelerin, enjeksiyon basıncı ve enjeksiyon zaman aralığında, doğru ses bolus üretmek için ayarlanabilir.
Morpholinos bir protein içindeki domain fonksiyonel diseksiyon da dahil olmak üzere birçok uygulama var. Özel ekzon-intron kavşaklar hedef için tasarlanmış, morpholinos orada meydana gelen ekleme önlemek. Biz iki morpholinos etkilerini araştırdık HEG pre-mRNA bağlama ekzon-intron kavşaklar. Morfolino heg_e3i3_egfr1 olgun transkript içine ekzon 3 içeren ekleme makine önlenmesi, ekzon 3 ve intron 3 arasında birleşme bağlar. Morfolino heg_e4i4_egfr2 benzer ekzon 4 kaldırır. Ekzon 3 ve 4. EGF gibi tekrarlar içeren etki alanı kodlamak. Bazı embriyolar heg_e4i4_egfr2 orta Fenokopisi mutant enjekte kalp gelişiminde ekzon 4 HEG rolünü anlamak için daha fazla deneyler gerekli olacaktır. Hayret, heg_e3i3_egfr1 enjekte embriyolarının beyin ödemi, HEG mutantlar görülen bir özellik değil. Bu Zigotik mutantlar etkilenmemiş olacaktır anne transkript bağlamak için morpholinos yeteneğine bağlı olabilir.
Acknowledgments
Biz kendi teknik yardım için Mably laboratuar ve Narie Storer üyeleri kabul ve Amerikan Kalp Derneği (NCRP Scientist Kalkınma Hibe 0635363N) ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü finansman için (Hibe SCCOR RFA HL02-027).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | MN 153 | |
| Needle Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P 97 | |
| Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100 F6 | |
| Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Needle Holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH310 |
References
- Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).
