Summary
Denna video visar hur morpholino eller mRNA kan injiceras i zebrafisk embryon vid ett-cell steg för att minska eller öka specifik gen produkter under senare utveckling.
Abstract
En av fördelarna med att studera zebrafisk är snabb och enkel att manipulera halter av protein i embryot. Morpholinos, som är syntetiska oligonukleotider med antisens komplementaritet att rikta RNA, kan läggas till embryot att minska uttrycket av en särskild gen produkt. Omvänt kan bearbetas mRNA läggas till i embryot att öka nivåerna av en gen produkt. Fordonet för att lägga till antingen mRNA eller morpholino att ett embryo är mikroinjektion. Mikroinjektion är effektiv och snabb, vilket möjliggör injektion av hundratals embryon per timme. Denna video visar alla steg som ingår i mikroinjektion. Kortfattat är ägg som samlats upp direkt efter utläggning och ställde upp mot ett objektglas i en petriskål. Nästa, en spetsig nål laddad med injektion material ansluten till en microinjector och en luft källa, och microinjector reglage justeras för att producera en önskvärd injektionsvolym. Slutligen är nålen störtade ner i embryots äggula och morpholino eller mRNA utvisas.
Protocol
Del 1: Äggproduktion och insamling
- Natten före injektion, ställa upp fisken i avel tankar med avdelare på plats. För att öka den totala äggproduktionen, kan fiskarna sättas upp i ett förhållande av två honor till en hane om så önskas.
- Följande morgon, efter att rummet tänds, dra avdelare från flera tankar och ge utrymme för ca 20 minuter ostörd parning tid.
- Med hjälp av en sil, samla in äggen ur avel burar och skölj dem med ägg vatten. Häll äggen i en petriskål med ägg vatten och ta bort obefruktade ägg och skräp med en överföringspipett. Fisk kan grupperas i större tankar för att producera ytterligare rundor av ägg för injektion. Justera tidpunkten för insamling av ägg för att tillåta maximalt antal ägg som skall produceras utan att låta dem passera en enda cell skede.
- Placera ett objektglas i inverterad locket på en 100 mm petriskål. Använd en överföringspipett att rada upp äggen mot sidan av bilden som en enda kolumn. Avlägsna överskott ägg vatten från bilden genom att trycka på en Kimwipe mot den motsatta sidan äggen. (Figur 1A)
Del 2: Needle drar, lastning och förberedelse
- Med en mikropipett avdragare, dra en 1,0 mm OD glas kapillär i två nålar och förvara i en 150mm petriskål med om under Silly Putty ramper. Nålar kan dras i förväg.
- Skjuta upp den nålen med 3 mikroliter av injektion material med hjälp av en microloader pipett. Skaka bolus mot nålspetsen tills det finns få eller inga bubblor kvar.
- Slå på luft-källa och microinjector. För in nålen i microinjector och försäkra en tät försegling inom bostadssektorn. Kontrollera att mikromanipulator är i lämpligt läge för att möjliggöra ett brett utbud av rörelse och justering. Ta nålspetsen i plan med tanke på i mikroskop, hög från scenen och fokusera på det tunnaste region i spetsen. Använd ett par vassa pincett för att nypa bort nålen på en punkt som lämnar nålen smal nog för att tränga igenom chorion och gulan, men fortfarande kan leverera en konsekvent pärla storlek. En droppe mineralolja på en mikrometer kan användas för att beräkna volymen för varje injektion. När det injiceras i olja, innehåller en pärla med en diameter på 0,1 mm 500 pl av injektion material (figur 1B), injektionsvolymer på 500 pL eller 1nL används normalt. Tryck ner fotpedalen och övervaka storleken på pärlan under trimningen nålen och justera insprutningstryck som behövs. Idealisk injektionsvolymer kommer att fylla ca 10% av ägget volym. Kvaliteten på nålspetsen är avgörande för både enkel injektion och den kvalitet och konsekvens av resultaten.
Del 3: Injection
- Se till att embryon som inte har utvecklat förbi fyra-cell skede. Helst bör embryon vara på en-cells skede.
- Sänk nålen mot kolonnen av ägg, håller skålen på plats med andra handen.
- Stick hål på ytan av chorion och ange gulan i en jämn takt medan du tittar på för krossning eller riva av gulesäcken. Injicera injektion materialet i äggulan (figur 1C). Undvik att injicera luftbubblor eller sträcka äggulan som antingen kan vara dödlig för embryot. Arbeta ner på linjen, justera trycket för att bibehålla en konsekvent pärla storlek och med hjälp av en pipett tips, ta bort ägg som ser obefruktade eller förstörs under injektionen processen.
- Efter att ha avslutat en kolumn med ägg, använd mild ström av ägg vatten för att flytta injiceras äggen i en ren petriskål. Upprepa vid behov. Hålla flera uninjected embryon som en kontroll. Vid slutet av dag ett, ta bort döda embryon och registrera antalet injicerade embryon. Byt ut ägget vattnet i skålen med jämna mellanrum för att minska risken för infektion.
Del 4: representativa resultat
Beroende på vad som injiceras, kan embryon överlever i en lägre takt än deras uninjected syskon. Lyckligtvis är det lätt att injicera ett stort antal av dem, så det är sällan ett problem. Det är normalt att morphants att uppvisa något fördröjd utveckling.
För att illustrera resultaten av mikroinjektion, använde vi detta protokoll för att manipulera nivåerna av proteinet Hjärta av glas (HEG). HEG är en transmembranös protein som krävs för normalt hjärta utveckling. I sin frånvaro, embryon utvecklas hjärtan med gigantiska inflödet traktater och kammare 1. Vi injicerade två tidigare obeskrivna morpholinos mot HEG heg_e3i3_egfr1 och heg_e4i4_egfr2, vid en koncentration av 500 mikroM. Vid 2 dagar efter befruktning, uninjected syskon kontroller verkar normala, som förväntat (Figur 2A och B). Embryon injiceras med heg_e3i3_egfr1 har hjärnödem (figur 2C). Även hjärtan flesta av dessa morphants ha ändrat morfologi, deras kamrarna är normalstor (figur 2D). Embryon injicerasmed heg_e4i4_egfr2 uppvisar varierande hjärtfel. Vissa verkar normala, medan andra har stora inflödet avtal och måttligt förstorade förmak (Figur 2E och F). Den HEG mutant, som tidigare rapporterats 1, har en enormt förstorad inflöde tarmkanalen och förmak (figur 2G och H).
Vi injicerade även wildtype embryon med 400 ng / mikroliter mRNA transkriberas från full längd HEG cDNA. Medan uninjected kontroller utvecklas normalt (figur 3A och B), embryon injiceras med HEG mRNA uppvisar ett spektrum av fenotyper från wildtype utseende till svår Cyclopia, förkortning av huvuddelen axeln, nekros av huvudet och kroppen, och mittlinjen defekter (figur 3C och D).
Figur 1. Embryon som skall injiceras är uppradade mot ett objektglas i en petriskål (A). Injektion volymen bestäms genom att injicera in i mineralolja placeras på en mikrometer. En injektion volym av 500 PL, som vanligtvis används, har en diameter på 0,1 mm (B). Omedelbart efter injektionen är morpholino eller mRNA synlig som en punktera plats i äggulan (C).
Figur 2. Vid 2 dagar efter befruktningen, uninjected embryon har inga grova fel (A) eller hjärta fenotyp (B). Embryon injiceras med morpholino heg_e3i3_egfr1 har hjärnödem (C, pil) men normalstor kamrar hjärta (D). Några embryon injiceras med morpholino heg_e4i4_egfr2 har utvidgat inflöde avtal och förmak (E, F). HEG mutanter har kraftigt förstorade inflöde avtal och förmak (G, H). (A), (C), (E) och (G) är 4x DIC bilder; (B), (D), (F) och (H) 20x DIC bilder. A = atrium, det = inflöde tarmkanalen.
Figur 3. 24 timmar efter befruktningen, uninjected embryon har en lång, rak kropp utan nekros eller mittlinjen defekter (A) och två klart definierade ögon med en neuralrörsdefekter mellan dem (B). Några embryon injiceras med HEG mRNA däremot uppvisar en kortare kropp axel, nekros, misshaped somites (C) och Cyclopia (D). (A) och (C) är 4x DIC bilder; (B) och (D) är 20x DIC bilder.
Discussion
En av styrkorna i zebrafisk-modellen är den lätthet med vilken specifik gen produkter kan läggas till eller avlägsnas från embryot genom mikroinjektion. För att ubiquitously överuttrycker ett visst protein, det mRNA kodning sprutas in i äggulan vid 1-cell skede. Under embryots fortsatta utveckling, är RNA distribueras i hela organismen och översatt. Omvänt, för att eliminera ett visst protein, är morpholinos används. Morpholinos är syntetiska oligonukleotider utformade med antisens kompletterar specifika RNA. Liksom mRNA är morpholinos sprutas in i äggulan på 1-cell skede. Inne i embryot de binder sitt mål-RNA, förebygga översättning.
Den viktigaste ändringen som behöver göras för varje morpholino eller mRNA är koncentrationen av injicerade materialet. För hög koncentration av antingen morpholino eller mRNA kan orsaka icke-specifik toxicitet, medan varje morpholino måste testas empiriskt för att bestämma sin optimala koncentration, typiskt morpholino koncentrationer mellan 200 mikroM och 500 mikroM slå ner geners aktivitet effektivt utan att orsaka icke-specifika fel. Den exakta storleken på nålen öppningen är inte avgörande. Inom ett intervall på nål storlekar, insprutningstryck och injektion tid kan justeras för att producera en bolusdos av rätt volym.
Morpholinos har många tillämpningar, inklusive den funktionella dissekering av domäner i ett protein. När utformade för att rikta specifika exon-intron korsningar kommer morpholinos förhindra skarvning uppstår där. Vi har undersökt effekterna av två morpholinos som binder exon-intron korsningar i pre-mRNA i HEG. Den morpholino heg_e3i3_egfr1 binder korsningen mellan exon 3 och intron 3, hindrar splitsningsmaskineriet från att ha exon 3 till mogna avskrifter. Den morpholino heg_e4i4_egfr2 bort liknande exon 4. Både exoner 3 och 4 koda domäner som innehåller EGF-liknande upprepas. Några embryon injiceras med heg_e4i4_egfr2 måttligt phenocopy den muterade, ytterligare experiment kommer att krävas för att förstå vilken roll HEG exon 4 i hjärtat utveckling. Överraskande, embryon injiceras med heg_e3i3_egfr1 har hjärnödem, en funktion som inte syns i HEG mutanter. Detta kan bero på förmåga morpholinos att binda moderns avskrifter som skulle vara opåverkad hos zygotic mutanter.
Acknowledgments
Vi erkänner medlemmar av Mably labbet och Narie Storer för tekniskt bistånd och American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) och National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) för finansiering.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | MN 153 | |
| Needle Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P 97 | |
| Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100 F6 | |
| Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Needle Holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH310 |
References
- Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).
