Summary
इस वीडियो से पता चलता है कैसे morpholino या mRNA एक सेल के बाद विकास के दौरान विशिष्ट जीन उत्पादों के स्तर में कमी या वृद्धि चरण में zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया जा सकता है.
Abstract
अध्ययन zebrafish का लाभ आसानी और भ्रूण में प्रोटीन के स्तर से छेड़छाड़ की गति है. Morpholinos, जो लक्ष्य RNAs antisense के complementarity के साथ सिंथेटिक oligonucleotides कर रहे हैं भ्रूण करने के लिए जोड़ा जा सकता है के लिए एक विशेष जीन उत्पाद की अभिव्यक्ति को कम है. इसके विपरीत, संसाधित mRNA भ्रूण करने के लिए जोड़ा जा सकता है एक जीन उत्पाद के स्तर में वृद्धि. वाहन microinjection एक भ्रूण या तो mRNA या morpholino जोड़ने के लिए है. Microinjection कुशल और तेजी से है, प्रति घंटे भ्रूण के सैकड़ों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है. यह वीडियो सभी microinjection में शामिल कदम से पता चलता है. संक्षेप में, अंडे तुरंत बाद दिया जा रहा एकत्र कर रहे हैं और एक पेट्री डिश में एक खुर्दबीन स्लाइड के खिलाफ लाइन में खड़ा है. अगले, एक ठीक इत्तला दे दी इंजेक्शन सामग्री के साथ भरी हुई सुई एक microinjector और एक एयर स्रोत जुड़ा हुआ है, और microinjector को नियंत्रित करने के लिए एक वांछनीय इंजेक्शन की मात्रा का उत्पादन करने के लिए समायोजित कर रहे हैं. अंत में, सुई भ्रूण की जर्दी में डूब जाता है और morpholino या mRNA निष्कासित कर दिया है.
Protocol
भाग 1: अंडों का उत्पादन, और संग्रह
- इंजेक्शन के लिए पहले रात, जगह में डिवाइडर के साथ प्रजनन टैंक में मछली सेट. कुल अंडा उत्पादन में वृद्धि करने के लिए, मछली दो महिलाओं के अनुपात में स्थापित कर सकते हैं और एक पुरुष को अगर वांछित.
- निम्नलिखित सुबह, कमरे में रोशनी के बाद पर बारी, कई टैंकों से डिवाइडर खींच और लगभग undisturbed संभोग के समय के 20 मिनट के लिए अनुमति देते हैं.
- एक झरनी का प्रयोग, प्रजनन पिंजरों से अंडे एकत्रित करते हैं और उन्हें अंडे पानी से कुल्ला. अंडे पानी के साथ एक पेट्री डिश में अंडे डालो और unfertilized एक हस्तांतरण विंदुक के साथ अंडे और मलबे को हटा दें. मछली बड़े टैंक में regrouped इंजेक्शन के लिए अंडे के अतिरिक्त राउंड का उत्पादन किया जा सकता है. अंडे संग्रह के समय को समायोजित करने के लिए दे उन्हें एकल कक्ष मंच से गुजारें के बिना उत्पादन किया जा अंडे की अधिकतम संख्या के लिए अनुमति.
- एक 100mm पेट्री डिश के उल्टे ढक्कन में एक खुर्दबीन स्लाइड प्लेस. एक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग करने के लिए एक एकल स्तंभ स्लाइड बनाने के पक्ष के खिलाफ अंडे लाइन. स्लाइड से अंडे के विपरीत पक्ष के खिलाफ एक Kimwipe दबाकर अतिरिक्त अंडे पानी निकालें. (चित्रा 1A)
भाग 2: सुई खींच, लोड हो रहा है, और तैयारी
- एक micropipette खींचने के साथ, एक 150mm पेट्री डिश में दो सुइयों और दुकान में मूर्ख पोटीन रैंप पर बिछाने एक 1.0mm आयुध डिपो केशिका गिलास खींच. सुई अग्रिम में खींचा जा सकता है है.
- इंजेक्शन एक microloader विंदुक का उपयोग कर सामग्री के 3 μL के साथ Backload सुई. सुई टिप की ओर सांस में हिलाओ जब तक वहाँ बहुत कम या कोई बुलबुले शेष हैं.
- हवा स्रोत और microinjector पर मुड़ें. Microinjector में सुई डालें और बीमा आवास के भीतर एक तंग सील. जाँच करें कि micromanipulator आंदोलन और समायोजन की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुमति देने के लिए एक उचित स्थिति में है. माइक्रोस्कोप के देखने के विमान, मंच से उच्च है, और टिप के thinnest क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने में सुई टिप ले आओ. तेज संदंश की एक जोड़ी का उपयोग एक बिंदु है जो सुई पियर्स chorion और जर्दी के लिए काफी संकीर्ण है, लेकिन अभी भी एक सुसंगत मनका आकार देने में सक्षम पत्ते पर बंद चुटकी सुई. एक micrometer पर खनिज तेल की एक बूंद प्रत्येक इंजेक्शन की मात्रा की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जब तेल में इंजेक्शन, 0.1 मिमी की एक व्यास के साथ एक मनका इंजेक्शन सामग्री के 500 PL (आंकड़ा 1B) शामिल हैं, 500 pl या 1nL के इंजेक्शन की मात्रा आम तौर पर उपयोग किया जाता है. पैर पेडल को दबाना और मोती के आकार की निगरानी जबकि सुई trimming और इंजेक्शन दबाव समायोजन के रूप में की जरूरत है. आदर्श इंजेक्शन संस्करणों अंडे की मात्रा का लगभग 10% भरना होगा. सुई टिप की गुणवत्ता दोनों इंजेक्शन के आराम और और परिणाम की गुणवत्ता और स्थिरता के लिए महत्वपूर्ण है.
भाग 3: इंजेक्शन
- सुनिश्चित करें कि चार सेल मंच अतीत भ्रूण विकसित नहीं किया है. आदर्श रूप में, भ्रूण एक सेल मंच पर किया जाना चाहिए.
- अंडे के स्तंभ की ओर सुई लोअर, आपके सामने हाथ के साथ जगह में पकवान पकड़े.
- पियर्स chorion की सतह और एक चिकनी स्ट्रोक में जर्दी में प्रवेश करते समय किसी भी कुचल या जर्दी थैली के फाड़ करने के लिए देख रहे हैं. जर्दी (आंकड़ा 1C) में इंजेक्शन सामग्री इंजेक्षन. हवाई बुलबुले या इंजेक्शन के रूप में या तो भ्रूण के लिए घातक हो सकता है जर्दी खींच से बचें. नीचे लाइन कार्य, दबाव के रूप में एक सुसंगत मनका आकार और एक विंदुक टिप का उपयोग कर बनाए रखने की जरूरत को समायोजित करने के लिए, जो अंडे unfertilized देखो या इंजेक्शन प्रक्रिया के दौरान नष्ट हो हटा दें.
- अंडे के एक स्तंभ को पूरा करने के बाद, अंडे पानी की एक सौम्य धारा का उपयोग करने के लिए एक साफ पेट्री डिश में इंजेक्शन अंडे चाल. आवश्यक के रूप में दोहराएँ. किसी नियंत्रण के रूप में कई uninjected भ्रूण रखें. एक दिन के अंत में, मृत भ्रूण को हटाने और इंजेक्शन भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड है. समय - समय पर संक्रमण का मौका कम करने के लिए डिश में अंडे पानी बदलें.
भाग 4: प्रतिनिधि के परिणाम
क्या अंतःक्षिप्त किया जा रहा है पर निर्भर करता है, भ्रूण उनके uninjected भाई बहन की तुलना में एक कम दर पर जीवित रह सकता है. सौभाग्य से, यह उनमें से बड़ी संख्या में इंजेक्षन करने के लिए आसान है, तो यह शायद ही कभी एक समस्या है. यह सामान्य है morphants के लिए थोड़ा देरी विकास प्रदर्शन.
Microinjection के परिणामों का उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम ग्लास प्रोटीन हार्ट (HEG) के स्तर में हेरफेर करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया. HEG एक transmembrane सामान्य दिल के विकास के लिए आवश्यक प्रोटीन है. इसके अभाव में, भ्रूण विशाल अंतर्वाह इलाकों और 1 कक्षों के साथ दिल का विकास . हम दो पहले undescribed morpholinos इंजेक्शन HEG, heg_e3i3_egfr1 और heg_e4i4_egfr2, के खिलाफ 500 सुक्ष्ममापी की एकाग्रता में . 2 दिनों के बाद निषेचन से कम, uninjected भाई नियंत्रण सामान्य दिखाई देते हैं, के रूप में की उम्मीद (आंकड़ा 2A और बी). Heg_e3i3_egfr1 साथ इंजेक्शन भ्रूण मस्तिष्क edema (आंकड़ा 2C) है. हालांकि इन morphants के अधिकांश के दिलों आकारिकी बदल दिया है, उनके कक्षों सामान्य आकार (आंकड़ा 2D) कर रहे हैं. भ्रूण इंजेक्शनheg_e4i4_egfr2 एक्ज़िबिट चर हृदय दोष के साथ. कुछ सामान्य दिखाई देते हैं, जबकि दूसरों को बड़ी आमद इलाकों और मामूली बढ़े atria (आंकड़ा 2E और एफ) है. HEG उत्परिवर्ती, के रूप में पहले एक रिपोर्ट, एक बेहद बढ़े अंतर्वाह पथ और आलिंद (आंकड़ा 2G और एच) है.
हम भी 400 एनजी / μL पूर्ण लंबाई सीडीएनए HEG से लिखित mRNA के साथ wildtype भ्रूण अंतःक्षिप्त . जबकि uninjected नियंत्रण सामान्य विकसित (आंकड़ा 3 ए और बी), भ्रूण HEG mRNA wildtype उपस्थिति से गंभीर cyclopia को लेकर phenotypes की एक स्पेक्ट्रम प्रदर्शन के साथ इंजेक्शन, मुख्य शरीर अक्ष, सिर और शरीर के परिगलन, और midline दोषों (आंकड़ा 3C का छोटा और डी).
चित्रा 1 करने के लिए इंजेक्शन जा भ्रूण को एक पेट्री डिश में एक खुर्दबीन स्लाइड (ए) के खिलाफ लाइन में खड़ा कर रहे हैं . इंजेक्शन की मात्रा एक micrometer पर रखा खनिज तेल में इंजेक्शन लगाने के द्वारा निर्धारित किया जाता है. 500 PL, जो आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है का एक इंजेक्शन की मात्रा 0.1 मिमी (बी) के एक व्यास है. इंजेक्शन के तुरंत बाद, morpholino या mRNA की जर्दी (सी) में एक टोकना स्थान के रूप में दिखाई देता है.
चित्रा 2 2 दिनों पोस्ट निषेचन, uninjected भ्रूण कोई सकल दोषों (ए) या दिल की phenotype (बी) है. Morpholino heg_e3i3_egfr1 साथ इंजेक्शन भ्रूण मस्तिष्क (सी, तीर) के edema लेकिन सामान्य दिल की कोठरियों आकार (डी) है. कुछ morpholino heg_e4i4_egfr2 के साथ इंजेक्शन भ्रूण बढ़े अंतर्वाह इलाकों और atria (ई, एफ) है. HEG म्यूटेंट गंभीर रूप से बढ़े हुए अंतर्वाह इलाकों और atria (जी, एच) है. (ए), (सी), (ई), और (G) 4x डीआईसी छवियों, (बी), (डी) (एफ) और (एच) 20x डीआईसी छवियाँ हैं. एक = atrium, यह = अंतर्वाह पथ.
चित्रा 3 24 घंटे के बाद निषेचन में uninjected भ्रूण नहीं परिगलन या midline (ए) उन्हें (बी) के बीच एक न्यूरल ट्यूब और दोष दो स्पष्ट रूप से परिभाषित आँखों के साथ एक लंबे, सीधे शरीर है. कुछ HEG mRNA के साथ इंजेक्शन भ्रूण, इसके विपरीत में, एक छोटा शरीर अक्ष, परिगलन, misshaped somites (सी), और cyclopia (डी) का प्रदर्शन. (ए) और (सी) 4x डीआईसी छवियाँ हैं, (बी) और (डी) 20x डीआईसी छवियाँ हैं.
Discussion
Zebrafish मॉडल प्रणाली की ताकत कितनी आसानी के साथ जो विशिष्ट जीन उत्पादों में जोड़ा जा सकता है या microinjection द्वारा भ्रूण से सफाया है. सर्वत्र एक विशेष प्रोटीन overexpress, mRNA एन्कोडिंग जर्दी में एक सेल मंच पर इंजेक्शन है. भ्रूण के बाद विकास के दौरान, शाही सेना जीव भर में वितरित किया जाता है और अनुवाद. इसके विपरीत, एक विशेष प्रोटीन को खत्म करने के लिए, morpholinos उपयोग किया जाता है. Morpholinos सिंथेटिक oligonucleotides antisense विशिष्ट RNAs के complementarity के साथ तैयार कर रहे हैं. MRNAs तरह morpholinos की जर्दी में एक सेल चरण में इंजेक्ट कर रहे हैं. भ्रूण के अंदर वे अपने लक्ष्य RNAs बाँध, अनुवाद को रोकने.
मुख्य संशोधन की जरूरत है कि प्रत्येक morpholino या mRNA के लिए बनाया जा इंजेक्शन सामग्री की एकाग्रता है. बहुत उच्च या तो morpholino या mRNA की एकाग्रता गैर विशिष्ट विषाक्तता का कारण हो सकता है, जबकि प्रत्येक morpholino empirically परीक्षण किया जाना चाहिए करने के लिए अपने इष्टतम एकाग्रता, आम तौर पर 200 सुक्ष्ममापी और 500 सुक्ष्ममापी के बीच morpholino सांद्रता का निर्धारण गैर विशिष्ट दोष के कारण के बिना नीचे जीन गतिविधि दस्तक प्रभावी ढंग से. सुई खोलने की सटीक आकार महत्वपूर्ण नहीं है. सुई आकार, इंजेक्शन के दबाव और इंजेक्शन समय की एक सीमा के भीतर के लिए सही मात्रा का एक सांस में उत्पादन करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.
Morpholinos एक प्रोटीन के भीतर डोमेन के कार्यात्मक विच्छेदन सहित कई अनुप्रयोगों, है. जब विशिष्ट एक्सॉन intron जंक्शनों लक्ष्य बनाया, morpholinos वहाँ से होने वाली splicing को रोकने जाएगा. हम दो morpholinos के प्रभाव की जांच की है कि बाँध एक्सॉन - intron HEG की mRNA पूर्व में जंक्शनों. morpholino heg_e3i3_egfr1 3 एक्सॉन और 3 intron के बीच जंक्शन बांध, परिपक्व टेप में एक्सॉन 3 शामिल से splicing मशीनरी को रोकने. morpholino heg_e4i4_egfr2 इसी तरह 4 एक्सॉन को निकालता है. दोनों exons 3 और 4 EGF की तरह दोहराता युक्त डोमेन सांकेतिक शब्दों में बदलना. कुछ भ्रूण heg_e4i4_egfr2 मामूली उत्परिवर्ती phenocopy इंजेक्शन के साथ, आगे के प्रयोगों के लिए हृदय विकास में एक्सॉन 4 HEG की भूमिका को समझने के लिए आवश्यक हो जाएगा. हैरानी की बात है, heg_e3i3_egfr1 साथ इंजेक्शन भ्रूण मस्तिष्क edema, सुविधा HEG म्यूटेंट में नहीं देखा है. यह morpholinos मातृ टेप है कि zygotic म्यूटेंट में अप्रभावित होगा बाँध की क्षमता के कारण हो सकता है.
Acknowledgments
हम Mably प्रयोगशाला और उनके तकनीकी सहायता के लिए Narie स्तोरेर के सदस्यों को स्वीकार करते हैं, और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (NCRP वैज्ञानिक विकास अनुदान 0635363N) और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (अनुदान SCCOR RFA HL02-027) के वित्तपोषण के लिए.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Microinjector | Tool | Harvard Apparatus | PLI 100 | |
| Micromanipulator | Tool | Narishige International | MN 153 | |
| Needle Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | P 97 | |
| Glass Capillaries | Tool | World Precision Instruments, Inc. | TW100 F6 | |
| Microloader Pipettes | Tool | Eppendorf | 5242956.003 | |
| Needle Holder | Tool | World Precision Instruments, Inc. | MPH310 |
References
- Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish. Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).
