Summary
이 동영상 기사에서 우리는 하이 포스트 - 해동 서바이벌 속도로 햄스터 oocytes를 수집하고 cryopreserve하는 방법에 대한 단계별 데모를 제시한다. 동일한 절차도 성공적으로 동결과 preimplantation 개발의 다른 단계에 마우스 배아를 해동 적용할 수 있습니다.
Abstract
언제 위팅엄 배아와 oocytes 처음으로 성공적으로 30여 년 전에 cryopreserved되었습니다
Protocol
동물 보호 절차 동물과 바르셀로나, 스페인 Universitat Autònoma 인간 연구에 대한 윤리위원회의 승인 지침과 규정에 따라 실시되었다.
I.의 Oocyte 컬렉션
- 두꺼운 질 분비물 (postovulatory 방전)의 존재에 대한 골든 시리아 변형의, 여성 햄스터 (8-12주의 옛 Mesocricetus auratus)을 확인하고 선택합니다.
- 60시간 나중에 PMSG 40 IU의 intraperitoneal 주사 (임산부 마레 세럼 생식 샘 자극 호르몬) hCG (인간 Chorionic 생식 샘 자극 호르몬)의 40 IU 다음으로 superovulate 선택한 여성을 유발.
- 16 시간 이산화탄소 챔버의 hCG의 관리 후 여성의 햄스터를 안락사.
- 로 비디오에 나타난 여성의 oviducts 격리하고 KSOM - H 매체의 드롭에게 전송할 수 있습니다.
- 37 hyaluronidase (156 U / ML)의 드롭 입체 현미경 수란관 ampulla을 이간하여 oocyte - 큐뮬러스 단지를 수집 ° C. Oocytes은 약 5 분 큐뮬러스 세포에서 해방된 것입니다.
- hyaluronidase의 oocytes을 들고 KSOM - H 매체에 두 번 그들을 씻으십시오.
마우스 배아의 수집을 위해, 여성 생쥐 (뮤스 musculus; 6-8주의 오래된)은 나중에 hCG 48 시간의 5 IU 다음과 남성 생쥐와 성관계를 PMSG 5 IU의 intraperitoneal 주사로 superovulate을 유도하고 있습니다. 암컷은 24-26에서 자궁 전위에 의해 희생되며, 44-46 또는 54-56시간 pronuclear, 2 셀 또는 4 셀 무대 배아, 각각의 obtention위한 hCG의 관리 후. 햄스터 oocytes에 대해 설명한 pronuclear 배아의 수집이 정확하게 수행됩니다. 2 셀 및 4 셀 단계에서 배아는 KSOM - H 매체 [6]로 oviducts 플러싱에 의해 저장됩니다.
참고 :이 프로토콜에 따라 약 20-30 oocytes / 배아 각 여성에서 수집한 수 있습니다.
II. 솔루션을 동결 융해의 준비
- KSOM - H (propilenglycol 1.5 M) 5 ML에 propilenglycol의 0.57 ML을 diluting로, 솔루션을 준비합니다.
- 0.2052 g의 자당 (자당의 0.3 M)와 튜브에 KSOM - H 2 ML를 추가하여 해동 솔루션을 준비합니다.
- 0.0684 g의 자당 (propilenglycol와 0.1 M의 자당 1.5 M)과 튜브에 솔루션 I 2 ML를 추가하여 냉동 솔루션을 준비합니다.
참고 : 솔루션 I 및 솔루션을 동결 융해가 그들의 사용하기 전에 준비를해야합니다. 그러나, 동결 융해 솔루션의 준비에 사용되는 자당의 지정된 금액을 사전에 가중치를하고 몇 개월 동안 상온에서 3 ML - 튜브에 저장되어있을 수 있습니다.
III. 냉동 프로토콜
- 전송 oocytes / KSOM - H 매체에서 솔루션 I의 드롭하고 실온에서 7~15분에 대해 품어 배아.
- 한편, 그것이 동영상 (각 솔루션 / 밀짚 1 방울)에 나와있는 솔루션을 동결 융해 90 μl 방울을 배치하여 빨대를 로드할 90mm 페트리 접시를 준비합니다.
- 냉동 솔루션 방울에 oocytes / 태아의 원하는 번호를 전송합니다.
참고 : 우리는 보통 5-30 oocytes 또는 태아 / 드롭 사이에 전송할 수 있습니다. - 입 제어 흡인 시스템에 빨대를 첨부하며이 순서를 따라 그것을 로드할 수 : 솔루션 I, 공기, oocytes, 공기, 해동 드롭, 공기 동결 드롭합니다.
- 짚으로이로드되면, 첫 번째 드롭은 빨대와 물개이를 상단 끝에있는 폴리머에 도달 (솔루션 I) 도입까지 aspirating 유지. 열 인감 플라스틱 플러그와 밀짚이나 인감의 다른 쪽 끝을.
- 프로그램 냉동고에 스위치와 냉동 프로그램을 선택합니다. 이 프로토콜에 사용되는 냉동이 프로그램은 원래 Lassalle 호텔 외 발행 냉각 속도에 따라 달라집니다. [7] :
- -7로 실온에서 2 ° C / 분 ° C
0 ° C / 10 분 분 시딩의 온도 평균 및 유도 수 있도록 (아래 참조) - -7에서 0.3 ° C / ° -30 분 ° C로 C
0 ° C / 2 분 분 온도 평균 수 있도록 - 35 ° C / 분, -30 ° C에서 -130 ° C로
- -7로 실온에서 2 ° C / 분 ° C
- 해동 솔루션의 드롭으로 빨대 부분이 바깥쪽을 향하게되어 있는지 확인하고, 프로그래밍 냉동실의 소유자의 슬롯에 빨대를로드합니다. 냉동 프로그램을 시작합니다.
- 샘플 온도 -7 ° C 및 냉각이 보류 중이라에 도달하면, 수동 시딩을 수행합니다 : 액체 질소에 빠지게 포셉는 즉시 해결책을 해동의 방울이 들어있는 빨대의 일부분을 노출 약간 밖으로 냉동실의 소유자를 당겨하고, 포셉와 짚으로이 부분을 터치. 홀더 각 소유자와 각 밀짚을 반복하고 끝날 때까지 실행 냉동 프로그램을 보자.
- 프로그램이 완료되면, 액체 질소의 소유자를 뛰어들다.
- 에서 빨대를 제거표시 gobelet에게 전송 보유자합니다.
- 마지막으로, 액체 질소 탱크 내부 gobelet를 저장합니다.
IV. 프로토콜을 해동
- 액체 질소 탱크에서 빨대를 제거합니다.
- 40 초전에 실내 온도에 빨대를 유지합니다.
- 40초 동안 30 ° C에서 물 목욕에 빨대를 적시게.
- 짚을에서 플러그를 제거하거나 열 봉인 팁 잘라.
- 35 mm 배양 접시에 짚을 비우기 부드럽게 냉동가 포함된 솔루션을 융해 두 방울을 섞는다.
- 실온에서 15 분 혼합물에서 oocytes / 배아를 남겨주세요.
- 37 추가 15 분 동안 KSOM - H의 새로운 드롭 oocytes / 배아를 전송 ° C.
- Oocytes / 배아는 이제 더 이상 조작을위한 준비가되어 있습니다.
참고 : 6 단계와 7 단계 동안은 해동 oocytes / 배아는 천천히 rehydration로 인해 팽창되는가 나타납니다.
V. 대표 결과
cryopreservation 프로토콜의 사용은 여기 햄스터 oocytes 약 95 %와> 90 %, 85% 각각 pronuclear, 2 셀, 4 셀 단계에서 마우스 B6CBAF1 배아 80 %의 생존율에 결과를 발표했다. 마우스 배아는 해동 후 KSOM에 체외에서 양식하는 경우, 적어도 70-80% 최적의 문화 환경에 blastocyst 단계에 도달해야합니다.
그것은 당신이 각 냉동 실험에서 그 oocytes / 배아의 제어 그룹 (빨대)를 포함하는 것이 좋습니다 oocytes / 태아의 나머지 부분이 추가 조작에 사용되기 전에이 그룹을 녹여. 컨트롤 그룹에 대한 생존 속도가 예상보다 낮은 경우, 같은 많은 다른 빨대를 녹여. 이 두 번째 그룹의 생존 속도도 낮은 경우이 동결 많은에서 남은 빨대를 폐기하십시오.
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Discussion
이 프로토콜의 햄스터 oocytes와 마우스 배아가 성공적으로 cryopreserved 수로. 일단 냉동, oocytes / 배아가 무한정 액체 질소 탱크에 저장하고 원하는 어떤 시간이나 장소에서 복구할 수 있습니다. 이것은 필요한 때마다 사용하는 샘플을 거의 준비가 갖는 장점을 제공합니다. 한편,이 프로토콜은 또한 라이브 동물 식민지의 유지 관리를 위해 경제적이고 안전한 대안으로 가치 마우스 종자 (예 : 유전자 변형 라인 등)에서 배아 cryobanks를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 햄스터 oocytes 및 하이브리드 B6CBAF1 마우스 배아를 cryopreserve하도록 최적화됩니다하는 것이 중요합니다. 다른 유전 배경과 마우스 배아 중 후 해동의 생존 요금의 차이는 치료가 각 종 또는 oocytes / 배아의 변형에 cryopreservation 조건을 평가하고 oocyte의 발생 전에 적절한 프로토콜을 확립하기 위해 이동해야하므로, 8,9을 설명했습니다 또는 배아 cryobanks.
햄스터 oocytes는 정자의 침투 시험 또는 정자의 염색체 분석 10, 또는 intracytoplasmic 정자 주입 (ICSI)에 초보자를위한 자료를 연습으로 인간 보조 생식 클리닉에서 사용할 수 있습니다. 한편, pronuclear 또는 2 셀 단계에서 마우스 하이브리드 B6CBAF1 배아가 배아 문화 미디어 또는 incubators의 적절한 기능의 품질을 확인하는 인간 보조 생식 센터 또는 연구소에서 사용할 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 스페인 정부의 드 Educación Y Ciencia (BIO 2006-11792)와 Generalitat 드 Catalunya (2005 - SGR00437)에 의해 지원되었다. 저자는 미디어를 준비하는 그들의 기술 지원을 마크 Puigcerver 및 Jonatan 루카스에게 감사를 표합니다. Servei D' Estabulari의 모든 직원은 동물의 주택에 대한 인정, 그리고이 비디오의 일부를 녹화에서 자신의 추가적인 기여 특히 후안 호세 마틴과 하비에르 베니토입니다. NCB가 Ciência E Tecnologia과 SG는 스페인 정부의 드 Educación Y Ciencia의 동료입니다 포르투갈어 Fundação 파라의 동료입니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
| French type mini-straw 0.25 ml | Mini-tub | 13407/0010 | ||
| hCG | Farma-Lepori, Spain | 749036.4 | ||
| Hyaluronidase | Sigma | H-3884 | ||
| KSOM-H medium | Ref. [11] | |||
| Liquid Nitrogen | Air Liquide | |||
| Plastic plugs | Mini-tub | 19046 | ||
| PMSG | Intervet, Spain | 1.614/8447 | ||
| Propilenglycol | Fluka | 82280 | ||
| Sucrose | Merck | 107687 | ||
| Surgical Scissors | Aesculap | BC-060R; BG-061R | ||
| Thermo-sealer | SIZ | 220 | ||
| 35 and 90 mm culture dishes | Nunc | 153066; 150350 | ||
| 10 ml tubes | Greiner Bio-one | 163160 | ||
| Nitrogen tank | MVE, Cryogenics | XC 43/28 | ||
| Programmable Freezer | Planner Products Ltd. | Kryo-10 Series III | ||
| Forceps | Aesculap | BD-331R; BD-053R; OC-020R |
References
- Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 °C. Science. 178, 411-414 (1972).
- Wilmut, I. The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing. Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).
- Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs. J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).
- Schneider, U. Cryobiological principles of embryo freezing. J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).
- Vajta, G., Kuwayama, M. Improving cryopreservation systems. Theriogenology. 65, 236-244 (2006).
- Duselis, A. R., Vrana, P. B. Retrieval of mouse oocytes. JoVE. 3, (2007).
- Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol. Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).
- Ibáñez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santaló, J. Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos. Cryobiology. 35, 290-298 (1997).
- Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing. Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).
- Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).
- Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM. Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).
