Summary
En utilisant la stimulation électrique à haute fréquence, la saisie-comme l'activité peut être induite dans
Abstract
Drosophila melanogaster est un outil utile pour étudier la saisie comme activité. Une variété de mutants dont les crises peuvent être induites soit par un choc physique ou la stimulation électrique est disponible pour l'étude des divers aspects de l'activité épileptique et de comportement. Toutes les mouches, y compris de type sauvage, va subir une saisie-comme activité si stimulés à une tension assez élevée. Saisie comme l'activité est une réponse tout-ou-rien et chaque génotype a un seuil de crise spécifique. Le seuil de la saisie d'un génotype spécifique de la mouche peut être modifiée soit par un traitement avec un médicament ou par la suppression génétique ou d'amélioration. Le seuil est facilement mesuré par l'électrophysiologie. Saisie-comme l'activité peut être induite par stimulation électrique à haute fréquence livrés directement au cerveau et enregistrées par les muscles dorsaux longitudinaux (DLMS) dans le thorax. La DLMS sont innervés par une partie du système de fibre géante. A partir de basse tension, la stimulation à haute fréquence, et ensuite élever la tension par petits incréments, le seuil de saisie pour une seule mouche peut être mesurée.
Protocol
Préparation des échantillons:
La nuit avant l'expérience, les mouches mâles du génotype désiré sont anesthésiés et placés dans un flacon avec un bouchon en nylon souple. Une boule de coton serait également travailler. Après l'anesthésie, le seuil épileptogène est altérée, alors les mouches sont mieux laisser pendant au moins 6 heures, bien que pendant la nuit est idéal.
Le jour de l'expérience, les mouches sont montées une à la fois des lames de verre avec une couche de cire dentaire sur un côté.
Une seule mouche est capté par la tête à l'aide d'une aiguille de calibre 23 (avec le bout pointu coupé) attaché à une ligne de vide.
La mouche est ensuite fixé à la cire sur la lame en poussant les pattes et les ailes dans la cire.
Une fois que la mouche est immobilisé, la cire est poussé autour du cou et les yeux pour bien immobiliser la tête.
Electrophysiologie:
La mouche, qui est maintenant monté et prêt à aller est placé dans l'électrophysiologie mis en place.
L'ensemble se compose d'électrophysiologie de trois ensembles de micromanipulateurs, chacun avec une à deux électrodes de tungstène aiguisé attaché. La tension est fournie par un stimulateur qui est connecté à une unité d'isolement attaché à l'électrode de stimulation. L'électrode d'enregistrement est connecté à un pré-ampli qui à son tour est relié à un oscilloscope à stockage numérique. Alors qu'il n'est pas indispensable, il est utile d'avoir un haut-parleur relié à l'oscilloscope afin que les réponses peuvent être rendue audible.
Une prise de terre est inséré dans l'abdomen de la mouche.
L'électrode d'enregistrement est inséré dans l'un des muscles dorsaux longitudinale dans le thorax de la mouche.
Les électrodes de stimulation sont insérés dans la tête. Un à côté de chaque œil.
Le stimulateur doit avoir les paramètres suivants pour commencer: l'intervalle d'impulsion continu avec 2 secondes entre chaque impulsion. Il devrait y avoir aucun retard d'impulsion. La largeur d'impulsion doit être 0,2 ms.
L'oscilloscope doit avoir la fonctionnalité de stockage activé et les paramètres suivants: Temps / DIV doit être réglé sur 1ms/DIV. VOLTS / DIV devrait être fixé à deux 0.1V/DIV ou 50 mV / div.
Le seuil de la fibre géante est déterminé par la prestation des impulsions uniques et notant la tension minimale requise pour obtenir une réponse. Cette tension est généralement autour de 2 V.
Une fois le seuil de la fibre géante a été déterminé, arrêtez pulsation à la volée et de modifier les paramètres sur l'oscilloscope: 0,2 s / div
Les réglages sur le stimulateur doit être modifié pour: L'intervalle d'impulsion devrait être fixé à un seul. Le train doit être activé et réglé à 3 secondes. Les paramètres de forme d'onde sont: 0,5 ms à impulsions 200Hz pendant 300 ms. La tension est changé pour le réglage désiré et un train à haute fréquence d'impulsions est livré au cerveau de la mouche.
Si une saisie n'est pas induite, la trace de l'oscilloscope affiche une ligne plate, après le train. Si les paramètres sont rapidement mis en revenir aux paramètres de départ, les impulsions uniques provoquera une réponse dans le système de fibre de géant.
Si une saisie est induite, l'oscilloscope montrent l'activité de saisie-comme après le train. Si les paramètres sont rapidement passé aux paramètres d'origine, les impulsions uniques ne parviendra pas à activer une réponse dans le système de fibre de géant.
Les mouches ont une période réfractaire après un train d'onde de stimulation à haute fréquence dans lequel la saisie comme l'activité ne peut être induite. Si aucune saisie survient les mouches sont réfractaires pendant environ 7 minutes. Si une saisie est induite, les mouches ont une période réfractaire d'environ 17 minutes.
Lors de la détermination du seuil, d'autres à haute fréquence des stimuli peuvent être livrés à la même mouche (après le moment approprié pour la période réfractaire) jusqu'à ce que le seuil est déterminé ou jusqu'à ce que la réponse de fibre géante devient trop faible pour voir.
Après l'expérience est terminée, la mouche est retiré de l'électrophysiologie mis en place, libéré de la cire, et éliminés.
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Discussion
Cette vidéo a démontré les étapes de base pour déterminer le seuil épileptogène d'une mouche drosophile individuels. Au lieu d'utiliser l'oscilloscope numérique, un numériseur informatique peut également être utilisé. Cette technique est utile pour déterminer les effets d'un médicament ou une modification génétique sur le seuil épileptogène d'une mouche.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH de recherche, une subvention de la Fondation Epilepsie et une subvention de la Fondation McKnight aux expériences sur les mouches des fruits MT drosophile ont été effectuées en conformité avec les directives et les règlements énoncés par le Comité UC Berkeley utilisation des animaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
