Summary
באמצעות גירוי חשמלי בתדר גבוה, תפיסת כמו פעילות יכול להיגרם ב
Abstract
תסיסנית melanogaster הוא כלי שימושי לחקר תפיסה כמו פעילות. מגוון מוטציות שבו ההתקפים יכול להיגרם דרך הלם פיזית או גירוי חשמלי זמין עבור לימוד היבטים שונים של הפעילות תפיסה והתנהגות. כל זבובים, כולל wild-type, יעברו התקף כמו פעילות אם מגורה במתח גבוה מספיק. תפיסה כמו הפעילות היא תגובה הכל או כלום גנוטיפ אחד יש סף התקף ספציפי. סף תפיסת גנוטיפ מסוים של זבוב ניתן לשנות באמצעות טיפול בתרופה או על ידי דיכוי או שיפור גנטי. הסף נמדד בקלות על ידי electrophysiology. תפיסה כמו פעילות יכול להיגרם באמצעות גירוי חשמלי בתדר גבוה ישירות אל המוח דרך רשמה את שרירי הגב האורך (DLMs) בתוך בית החזה. DLMs מעוצבבים על ידי חלק של מערכת סיבים ענק. החל גירוי נמוך, מתח בתדר גבוה, ולאחר מכן העלאת מתח במרווחים קטנים, סף התקף עבור לטוס יחיד ניתן למדוד.
Protocol
הדגימה אופן ההכנה:
בלילה שלפני הניסוי, זבובים זכרים של הגנוטיפ הרצוי מורדמים והושמו בקבוקון עם תקע ניילון רך. כדור צמר גפן היה גם לעבוד. לאחר הרדמה, סף התקף משתנה, כך הזבובים הם עזבו ביותר לפחות 6 שעות, אם כי במשך הלילה הוא אידיאלי.
ביום הניסוי, הזבובים הם רכובים אחד בכל פעם כדי שקופיות הזכוכית בשכבת שעווה שיניים בצד אחד.
זבוב אחד הוא הרים ראש באמצעות מחט מד 23 (עם קצה חד לחתוך) מוצמד לקו ואקום.
לעוף היא מודבקת ואז השעווה בשקופית על ידי לחיצה על רגליים וכנפיים בשעווה.
לאחר לטוס היא משותקת, שעווה נדחף סביב הצוואר והעיניים כדי לשתק לגמרי את הראש.
Electrophysiology:
לעוף, אשר מותקן עכשיו ומוכן ללכת ממוקם electrophysiology להגדיר.
קבוצת electrophysiology למעלה מורכב משלושה סטים של micromanipulators, כל אחד עם 1-2 אלקטרודות טונגסטן חידד המצורפת. מתח מסופק על ידי ממריץ המחובר יחידת הבידוד מחוברת האלקטרודות מגרה. אלקטרודה ההקלטה מחובר המגבר מראש אשר בתורו מחובר אוסצילוסקופ אחסון דיגיטלי. אמנם זה לא הכרחי, כדאי להיות הדובר מחוברת אוסצילוסקופ, כך התגובות ניתן נשמע.
אלקטרודה הקרקע מוכנס לתוך הבטן של הזבוב.
אלקטרודה ההקלטה מוכנס לתוך אחד השרירים אורך הגב של בית החזה של הזבוב.
האלקטרודות מוחדרות לתוך מגרה הראש. אחת לצד כל עין.
ממריץ צריך את ההגדרות הבאות כדי להתחיל: מרווח דופק רציף עם 2 שניות בין הדופק בכל. לא צריך להיות שום עיכוב הדופק. רוחב הדופק צריך להיות 0.2ms.
אוסצילוסקופ צריך את התכונה אחסון מופעל יש את ההגדרות הבאות: Time / DIV צריך להיות מוגדר 1ms/DIV. וולט / DIV צריך להגדיר או 0.1V/DIV או 50 mV / div.
הסף של סיבים ענק נקבעת על ידי מתן פולסים יחיד וציין את המתח המינימלי הנדרש כדי לקבל תגובה. מתח זה הוא בדרך כלל סביב 2 V.
לאחר סף סיבים ענק נקבע, פועם להפסיק את הזבוב לשנות את ההגדרות על אוסצילוסקופ אל: 0.2 S / DIV
הגדרות על ממריץ יש לשנות ל: רווח הדופק צריך להיות מוגדר יחיד. הרכבת צריכה להיות מופעלת ומוגדרת 3 שניות. הפרמטרים waveform הם: 0.5 ms ב 200Hz פולסים של 300 מילישניות. מתח משתנה ההגדרה הרצויה רכבת בתדירות גבוהה של קטניות מועבר למוח של זבוב.
אם ההתקף לא מושרה, עקבות אוסצילוסקופ יראה קו שטוח לאחר הרכבת. אם ההגדרות נקבעות במהירות בחזרה להגדרות המוצא, קטניות בודד יגרום תגובה במערכת סיבים ענק.
אם התקף מושרה, אוסצילוסקופ יציג את פעילות ההתקפים דמויי לאחר הרכבת. אם הגדרות מוחלפות במהירות בחזרה להגדרות המקוריות, קטניות יחיד ייכשל כדי להפעיל תגובה של מערכת סיבים ענק.
הזבובים יש תקופה עקשן לאחר wavetrain בתדירות גבוהה גירוי שבו תפיסה כמו פעילות לא יכול להיגרם. אם לא מתרחשת תפיסת זבובים הם עקשן כ 7 דקות. אם התקף מושרה, הזבובים יש עקשן תקופה של כ 17 דקות.
בעת קביעת סף, נוסף בתדירות גבוהה בגירויים יכול להיות מועברת להטיס אותו (לאחר זמן המתאים לתקופה עקשן) עד לסף נקבעת או עד התגובה סיבים ענק הופך חלש מדי כדי לראות.
לאחר הניסוי הושלם, לטוס יוסר electrophysiology להגדיר, שוחרר מבית השעווה, ואת להיפטר ממנו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרט הווידאו הזה הוכיח את הפעולות הבסיסיות בקביעת סף התקף של זבוב תסיסנית בודדים. במקום להשתמש אוסצילוסקופ דיגיטלי, digitizer ממוחשב עשוי לשמש גם. טכניקה זו שימושית עבור לקבוע את ההשפעות של התרופה או שינוי גנטי על סף התקף של זבוב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר NIH, קרן אפילפסיה מענק קרן מק 'נייט להעניק MT ניסויים על זבובים תסיסנית פרי בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי ועדת ברקלי שימוש בבעלי חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digital oscilloscope | Hitachi | VC-6523 | |
| Stimulator | Cornerstone | S-900 | |
| Preamplifier | World Precision Instruments, Inc. | Electro 705 | |
| Micromanipulators | Narishige International | various |
References
- Kuebler, D., Tanouye, M. A. Modifications of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 83, 998-1009 (2000).
- Kuebler, D., Zhang, H., Ren, X., Tanouye, M. A. Genetic suppression of seizure susceptibility in Drosophila. J Neurophysiol. 86, 1211-1225 (2001).
- Song, J., Tanouye, M. A. Seizure suppression by shakB2, a gap junction mutation in Drosophila. J Neurophysiol. 95, 627-635 (2006).
