Summary
تحقيق الجودة العالية وكمية مناسبة من الجزر الإنسان هي واحدة من أبرز الشروط لنجاح زرع جزيرة. في هذا الفيديو ، ونحن تصف خطوة بخطوة لإجراءات العزل جزيرة البنكرياس الإنسان (الجزء الأول : الهضم ، وجمع من نسيج البنكرياس) باستخدام طريقة تعديل الآلي.
Abstract
إدارة مرض السكري نوع 1 هو مرهقة ، سواء على الفرد والمجتمع ، وتكلف أكثر من 100 مليار دولار سنويا. على الرغم من الاستخدام الواسع النطاق للرصد الغلوكوز والانسولين صياغات جديدة ، وتطوير العديد من الأفراد لا تزال مضاعفات ثانوية مدمرة. ويمكن زرع البنكرياس جزيرة بالقرب من استعادة السيطرة على مستويات الجلوكوز الطبيعي في مرضى السكري
Protocol
1. مرفق الإعداد
- الإنسان عزلة الجزيرة هو إجراء الوقت الحساسة التي تنطوي على العمل الجماعي ، وبالتالي ، هناك حاجة إلى أربعة أشخاص لإجراء هذا الإجراء. ويقوم الفريق بقيادة الجراح الذي يشرح وcannulates البنكرياس.
- عزلة الجزيرة تبدأ في اللحظة التي يدخل فريق جزيرة العزلة UIC المرفق. أعضاء فريق التأكد من أن جميع الأجهزة اللازمة ، مثل أجهزة الطرد المركزي ، ويتم التحقق قيد التشغيل. أيضا التأكد من أنهم لتعقيم جميع اغطية والسطوح.
- سوف شخصين إعداد جدول إقناء ؛ إدخال القنية ، وآلة للتبذير ، والدوائر الهضم ، وحدة التروية ، كوبي آلة التنقية ، والجداول الجراحية.
- في نفس الوقت ، سوف اثنين من أعضاء الفريق الآخر إعداد وسائل الاعلام ان هناك حاجة خلال العزلة.
- المقبل ، وتعد أنابيب البكتريولوجيا (الزجاجات والأنابيب وشكل وكيس) ، وأنابيب أخذ العينات (ما قبل مليئة يغسل) ، وأنابيب وألواح التقييم.
- إعداد أنبوب تنقية النحو التالي : 1 أنبوب فارغة وضعت في 150 مل ، وأنابيب مملوءة 2-12 200 مل من وسائل الاعلام M199 تستكمل مع الإنسان (محلول الغسيل) الألبومين وضعت في 230 مل ، وأخيرا أنبوب واحد مل 50 المخروطية مليئة 50 مل من محلول الغسيل. بمجرد إعداد هذه الخطوات هي كاملة ونحن على استعداد لبدء إعداد وperfusing البنكرياس.
2. إعداد البنكرياس ونضح
- لبدء الإعداد ونضح من البنكرياس ، وهو عامل من يزيل الجهاز باستخدام تقنية التغليف المعقم. وسوف يقوم الجراح نقل البنكرياس إلى طاولة التطهير.
- وسوف يقوم الجراح ملء أحد حقنة 60 مل مع الحل البنكرياس الحفاظ الأصلي وتسليمه لأحد المشغلين ، الذي سيتم استخدامه لملء الزجاجات المعدة "المشتريات" الجراثيم.
- بعد الفحص البصري لتحديد ما إذا كان الجهاز هو مناسب لعزل الجزيرة (في حالة تلف البنكرياس خلال الشراء أو غير طبيعية تشريحيا ، قد لا يمكن استخدامه لعزل الجزيرة) ، سوف الجراح يطلب من عامل لإعداد كولاجيناز. نتذكر أن ذلك الوقت إعادة تعليق يتراوح بين الماركات المختلفة ، والكثير الانزيم.
- عندما الجراح مستعد ، وجلب الحلول التطهير (Betadine ، Fungizone / سيفازولين وHBSS) الى طاولة المفاوضات من أجل إزالة التلوث ، ومنهم في حاويات مناسبة. الجراح ينفذ التطهير البنكرياس الغسيل لمدة دقيقة والبنكرياس في كل من الحل إزالة التلوث. ثم يوضع البنكرياس في جرة صغيرة معقمة الذي توزن به. بعد إدخال وزن في السجل الدفعي ، ويوضع البنكرياس في عموم إقناء ؛ إدخال القنية مع بعض الحلول للحفظ.
- وكشف الجراح وجزئيا شق القناة الرئيسية ويقني ؛ يدخل القنية كل شوط من البنكرياس مع قنية. وسيتم تأمين قنية بواسطة خياطة. ليروي البنكرياس ، حرك لأول مرة إلى وحدة ونضح من أجل حل الانزيم في الحوض. إجمالي الوقت نضح حوالي 10 دقيقة ، بمعدل 80 ملم زئبقي لمدة 5 دقائق ، ثم عند 180 مم زئبق لمدة 5 دقائق. منتفخة البنكرياس بعد نضح.
- نقل البنكرياس perfused لعموم إقناء ؛ إدخال القنية ، حيث يتم قطع الأنسجة الدهنية من البنكرياس بعناية. ثم قص البنكرياس في 10-12 القطع ونقلها إلى غرفة Ricordi للهضم.
3. البنكرياس الهضم
- لبدء خطوة عملية الهضم ، ونقل البنكرياس إلى الدائرة Ricordi فارغة ، إضافة واحد مل فيال 2.5 من Pulmozyme ، وطرح على الشاشة (تجنب جزءا كبيرا من كتلة النسيج غرفة) ، على مقربة من القاعة ، وتملأ النظام.
- بدء ضخ المحلول لمدة 5 دقائق. صخرة بلطف الغرفة لتفريق بالتساوي حل الدافئة طوال الوقت. بعد خمس دقائق ، ويهز بلطف الغرفة للمرحلة الهضم برمتها. المحافظة على درجة حرارة 37 ˚ C.
- موسيقى الروك في غرفة بلطف حتى تصل درجة الحرارة الى 37 درجة مئوية ، ثم يهز الغرفة. أخذ عينة كل دقيقتين وكشف إذا تم العثور على الجزر حرة تحت نطاقها. تسجيل معلومات التقييم جزيرة في الجدول الهضم من المحضر دفعة واحدة. تواصل رصد نسبة الجزر حتى هناك 50 ٪ منهم من التعويم ومعزولة في الحل.
4. جمع الأنسجة
- مرة واحدة تم العثور على 50 ٪ من الجزر الحرة في العينات ، وتوقف عملية الهضم وذلك بإضافة الباردة حل تخفيف RPMI في الدائرة. ويتم جمع الأنسجة في أنابيب مخروطية 500 مل قبل مليئة الزلال 30 مل الإنسان. حالما يتم نسج أنابيب شفط قبالة طاف بيليه وتغسل بمحلول الغسيل الباردة. تدور الأنابيب المخروطية في 1100 دورة في الدقيقة (التناوب في الدقيقة) لمدة 1 دقيقة ، 4 ˚ جيم
- الجمع بين جميع أنابيب جمع العالقة مع أنسجة البنكرياس هضمها في المخروطية واحد 500 مل. عندما أنبوب مليء الأنسجة غسلها ، وتدور وتكرار عملية الغسيل حتى تم غسلها جميع أنسجة عدة مرات. تدور هذه الأنابيب ونقل الأنسجة في أنبوب واحد 250 مل المخروطية. جعل حجم ما يصل الى 250 مل معM199 حل الغسيل تستكمل مع HA والاستعداد لأخذ العينات.
- أخذ عينة 1 مل مع ماصة وإضافة إلى أنبوب 15 مل المخروطية قبل مليئة 9 مل من محلول الغسيل. ثم مزيج من قلب بلطف أنبوب مخروطي 15 مل و من هذا ، من أصل عينة 1ml مباشرة في صحن شبكة العد. عدد الخلايا ، وحساب عدد الخلايا باستخدام عامل إضعاف 2500 (10x250).
- تدور في أنبوب 250 مل المخروطية وإضافة 150 مل من UW (جامعة ويسكونسن) التي تستخدم عادة الحل للحفاظ على الجهاز. عند إضافة UW ، مزيج تعليق الخلية بدقة باستخدام ماصة. سجل والتواصل للمشغل لتنقية وقت البدء في UW. ترك الأنبوب (ق) على الجليد ودوامة أحيانا. الآن يمكن تنقيته من جزر أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهناك مجموعة متنوعة من العوامل التي تؤثر على نتائج العزلة 9،10. فيما بينها ، والهضم للانسجة البنكرياس يلعب دورا بارزا. بناء على منطقتنا الإنسان جزيرة تجربة العزلة ، لخص لنا النقاط التالية الحاسمة ، التي يمكن أن تؤثر المحتمل أن تسفر جزيرة والجودة.
- الوقت الهضم يختلف عندما تستخدم أنواع مختلفة من الانزيمات.
- حالما 40-50 ٪ من الجزر الصغيرة تفصل تماما عن النسيج عنيبية ، يجب أن تتوقف على الفور عملية الهضم من خلال إضافة محلول تخفيف وتهدئة الأنسجة.
- التعامل مع طيف من النسيج عند جمع الغسيل ، والاختلاط.
- وينبغي أن يوضع الخليط من الأنسجة التي تم جمعها وحل يسكونس على الجليد لمدة لا تقل عن 30 دقيقة من أجل الحصول على نتيجة أفضل لتنقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بدعم من التمويل من جامعة إلينوي في شيكاغو ، وكذلك جزيرة الخلية مركز موارد منحة المعاهد الوطنية للصحة (RFA - RR 05-003) ، ومؤسسة كريستوفر ، ومؤسسة Efroymson ، ومؤسسة Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
