Summary
उच्च गुणवत्ता और मानव islets की उचित मात्रा में हासिल सफल आइलेट प्रत्यारोपण के लिए प्रमुख किसी और चीज की की है. इस वीडियो में, हम कदम से कदम का वर्णन मानव अग्नाशय आइलेट अलगाव के लिए प्रक्रियाओं (भाग मैं: पाचन और अग्नाशय के ऊतकों का संग्रह) एक संशोधित स्वचालित पद्धति का उपयोग कर.
Abstract
टाइप 1 मधुमेह के प्रबंधन को भारी है, दोनों व्यक्ति और समाज के लिए, 100 से अधिक अरब डॉलर सालाना लागत. ग्लूकोज की निगरानी और नए इंसुलिन योगों के व्यापक उपयोग के बावजूद, कई व्यक्तियों को अभी भी विनाशकारी माध्यमिक जटिलताओं के विकास. अग्नाशय आइलेट प्रत्यारोपण मधुमेह के रोगियों में सामान्य ग्लूकोज नियंत्रण के पास बहाल कर सकते हैं
Protocol
1. सुविधा सेटअप
- मानव आइलेट अलगाव एक समय संवेदनशील प्रक्रिया है कि एक साथ काम करना शामिल है, और इसलिए, चार व्यक्तियों को इस प्रक्रिया का संचालन करने के लिए की जरूरत है. टीम सर्जन है, जो dissects और अग्न्याशय cannulates के द्वारा सीसा है.
- आइलेट अलगाव मिनट शुरू होता है टीम यूआईसी आइलेट अलगाव की सुविधा में प्रवेश करती है. टीम के सदस्यों को सुनिश्चित करना है कि सभी आवश्यक इंस्ट्रूमेंटेशन, अपकेंद्रित्र तरह की जाँच की, और चालू. उन्होंने यह भी करने के लिए सभी डाकू और सतहों sanitize सुनिश्चित करें.
- दो लोगों को cannulation मेज, कीचड़ मशीन, पाचन सर्किट, छिड़काव इकाई, COBE शुद्धि मशीन, और शल्य चिकित्सा तालिकाओं सेट हो जाएगा.
- इसके साथ ही, दो अन्य टीम के सदस्यों को मीडिया है कि अलगाव के दौरान की जरूरत है तैयार करेंगे.
- अगले, जीवाणु ट्यूबों (बोतलें, ट्यूब, फार्म, और बैग), नमूने ट्यूबों (धोने के साथ पहले से भरे), और मूल्यांकन ट्यूब और प्लेटें तैयार हैं.
- शुद्धि निम्नानुसार सेट ट्यूब तैयार: 1 खाली ट्यूब और 150 मिलीलीटर में चिह्नित, 2-12 ट्यूबों M199 मानव albumin (धोने समाधान) के साथ पूरक मीडिया के 200 मिलीलीटर के साथ भरा और 230 मिलीलीटर में चिह्नित है, और अंत में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब धोने के समाधान के 50 मिलीलीटर से भरा है. एक बार इन तैयारी चरणों को पूरा हम करने की तैयारी और अग्न्याशय perfusing शुरू करने के लिए तैयार हैं कर रहे हैं.
2. अग्न्याशय तैयारी और छिड़काव
- तैयारी और अग्न्याशय का छिड़काव शुरू करने के लिए, एक ऑपरेटर बाँझ पैकेजिंग तकनीक का उपयोग कर से अंग को ही निकाल. सर्जन परिशोधन तालिका अग्न्याशय स्थानांतरण होगा.
- सर्जन मूल अग्न्याशय संरक्षण समाधान और यह एक ऑपरेटर, जो इसे का उपयोग करने के लिए तैयार "प्रोक्योर्मेंट" जीवाणु बोतलों को भरने के लिए हाथ के साथ एक 60 मिलीलीटर सिरिंज को भरने जाएगा.
- एक दृश्य निरीक्षण के लिए तय है कि अंग आइलेट अलगाव (यदि अग्न्याशय खरीद के दौरान क्षतिग्रस्त है या anatomically असामान्य, यह आइलेट अलगाव के लिए नहीं किया जा किया जा सकता है) के लिए उपयुक्त है के बाद, सर्जन collagenase तैयार ऑपरेटर पूछना होगा. याद रखें कि उस समय फिर निलंबन अलग एंजाइम ब्रांडों और बहुत सारे के बीच बदलता है.
- जब सर्जन तैयार है, परिशोधन समाधान लाने (Betadine, Fungizone / Cefazolin और HBSS) परिशोधन तालिका और उन्हें उपयुक्त कंटेनर में डाल. सर्जन अग्न्याशय एक मिनट के लिए परिशोधन समाधान के प्रत्येक में अग्न्याशय धोने परिशोधन करता है. अग्न्याशय फिर जिसमें यह तौला जाएगा एक छोटे बाँझ जार में रखा गया है. के बाद वजन बैच रिकार्ड में दर्ज किया जाता है, अग्न्याशय cannulation पैन में कुछ संरक्षण समाधान के साथ रखा गया है.
- सर्जन बेनकाब और आंशिक रूप से मुख्य वाहिनी काटकर अलग कर देना और एक cannula के साथ अग्न्याशय के प्रत्येक आधा cannulate जाएगा. प्रवेशनी सीवन द्वारा सुरक्षित हो जाएगा. अग्न्याशय perfuse करने के लिए, पहले यह छिड़काव इकाई के लिए कदम है और बेसिन में एंजाइम समाधान डालना. कुल छिड़काव समय के बारे में 10 मिनट, 5 मिनट के लिए 80 mmHg पर है, तो 5 मिनट के लिए 180 mmHg पर. अग्न्याशय छिड़काव के बाद distended.
- Cannulation पैन perfused अग्न्याशय, जहां फैटी ऊतक अग्न्याशय से छंटनी की है, ध्यान से ले जाएँ. फिर 10-12 टुकड़ों में अग्न्याशय में कटौती और पाचन के लिए Ricordi चैंबर के लिए स्थानांतरण.
3. अग्न्याशय पाचन
- पाचन कदम शुरू करने के लिए, खाली Ricordi चैंबर के लिए अग्न्याशय हस्तांतरण, Pulmozyme की 2.5 मिलीलीटर शीशी, स्क्रीन पर डाल दिया है (ऊतक ब्लॉक का बड़ा हिस्सा चैम्बर से बचने) जोड़ने के लिए, कक्ष बंद, और प्रणाली को भरने.
- 5 मिनट के समाधान के लिए पम्पिंग शुरू करो. धीरे चैम्बर रॉक करने के लिए समान रूप से गर्म समाधान फैलाने भर. पांच मिनट के बाद, धीरे पूरे पाचन चरण के लिए कक्ष हिला. 37 में तापमान बनाए रखें ˚ सी.
- चैम्बर रॉक धीरे जब तक तापमान 37 °, तब कक्ष हिला तक पहुँचता है. एक नमूना हर दो मिनट ले लो और पता लगाने अगर मुक्त islets के दायरे के अंतर्गत पाया जाता है. बैच रिकॉर्ड के पाचन तालिका में आइलेट मूल्यांकन जानकारी रिकॉर्ड. Islets के प्रतिशत की निगरानी जारी रखें जब तक उनमें से 50% समाधान में स्वतंत्र और अलग चल रहे हैं.
4. ऊतक संग्रह
- एक बार islets के 50% के नमूनों में मुक्त पाए जाते हैं, पाचन सर्किट में ठंड RPMI कमजोर पड़ने समाधान जोड़कर बंद कर दिया है. ऊतक 500 मिलीलीटर शंक्वाकार पूर्व 30 मिलीलीटर मानव albumin के साथ भरा ट्यूबों में एकत्र की है. एक बार ट्यूबों काता चूषण सतह पर तैरनेवाला बंद और ठंड धोने के समाधान के साथ गोली धोने. 1 मिनट, 4 ˚ सी के लिए 1100 RPM को (प्रति मिनट rotations) पर शंक्वाकार ट्यूबों स्पिन
- सभी संग्रह पचा अग्नाशय के ऊतक के साथ एक एकल 500 मिलीलीटर शंक्वाकार में निलंबित ट्यूबों मिश्रण. जब एक ट्यूब धोया ऊतक के भरा हुआ है, स्पिन, और कपड़े धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ जब तक सभी ऊतक कई बार धोया गया है. इस ट्यूब स्पिन और एक एकल 250 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में ऊतक हस्तांतरण. मात्रा लाओ 250 मिलीलीटर के साथहा M199 धोने के समाधान के साथ पूरक है और नमूना लेने के लिए तैयार है.
- एक विंदुक के साथ एक 1 मिलीलीटर नमूना ले लो और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार धोने के समाधान के 9 मिलीलीटर के साथ पहले से भरे ट्यूब के लिए जोड़ें. फिर धीरे inverting 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और इस से मिश्रण, 1ml बाहर नमूना सीधे एक ग्रिड गिनती डिश में. कोशिकाओं की गणना, और सेल नंबर का उपयोग कर पच्चीस सौ (10x250) के कमजोर पड़ने कारक की गणना.
- 250 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन और UW (विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय) समाधान है कि आमतौर पर अंग संरक्षण के लिए उपयोग की 150 मिलीलीटर जोड़ें. जब UW जोड़ा जाता है, सेल निलंबन मिश्रण अच्छी तरह से पिपेट का उपयोग कर. UW में शुरू समय रिकार्ड और शुद्धि ऑपरेटर के लिए संवाद. बर्फ और कभी कभी ज़ुल्फ़ पर ट्यूब (ओं) को छोड़ दें. अब islets के आगे शुद्ध किया जा सकता है.
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Discussion
वहाँ अलगाव 9,10 परिणाम को प्रभावित करने वाले कारकों की एक किस्म हैं. उनमें से, अग्नाशय के ऊतक के पाचन एक प्रमुख भूमिका निभाता है. अपने स्वयं के मानव आइलेट अलगाव अनुभव के आधार पर, हम निम्नलिखित महत्वपूर्ण बिंदुओं, जो संभवतः आइलेट उपज और गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता संक्षेप.
- पाचन समय अलग है जब एंजाइमों के विभिन्न प्रकारों का उपयोग कर रहे हैं.
- के रूप में पूरी तरह से कोष्ठकी ऊतकों से अलग islets के 40-50% के रूप में जल्द, पाचन कमजोर पड़ने समाधान जोड़ने और नीचे ऊतक ठंडा करके तुरंत रोका चाहिए.
- जब ऊतक के कोमल हैंडलिंग का संग्रह, धोने, और मिश्रण.
- एकत्र ऊतक और UW समाधान के मिश्रण को कम से कम 30 मिनट के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए क्रम में करने के लिए बेहतर शुद्धि परिणाम प्राप्त.
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Acknowledgments
शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय के रूप में अच्छी तरह के रूप में आइलेट सेल संसाधन केंद्र NIH अनुदान (RFA-05-003 आर आर), क्रिस्टोफर फाउंडेशन, Efroymson फाउंडेशन, और Tellabs फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
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