Summary
높은 품질과 인간 아일 레츠의 적절한 수량을 달성하는 것은 성공적인 아일릿 이식을 위해 유명 전제 조건 중 하나입니다. 이 비디오에서는, 우리는 단계별로 설명을 인간의 췌장 아일릿 절연을위한 절차 : 수정된 자동화된 방법을 사용하여 (부분 I 소화 및 췌장 조직의 수집).
Abstract
1 형 당뇨병의 관리는 매년 100여 억 달러를 비용, 모두 개인과 사회에, 부담합니다. 포도당 모니터링 및 새로운 인슐린 공법의 광범위한 사용에도 불구하고, 많은 사람은 여전히 파괴적인 보조 합병증을 개발합니다. 췌장 아일릿 이식은 당뇨병 환자에서 정상적인 혈당 조절 근처에 복원할 수 있습니다
Protocol
1. 시설 설치
- 인간 아일릿 절연은 팀웍과 관련된 시간 민감한 절차이며, 따라서, 넷 개인이 절차를 수행하기 위해 필요합니다. 팀은 dissects과 췌장을 cannulates 외과 의사에 의해 리드입니다.
- 아일릿 절연은 팀이 UIC 아일릿 격리 시설을 입력하는 순간을 시작합니다. 팀 구성원은 필요한 모든 장비는 원심 분리기와 같은 검사입니다 켜져 있는지 확인하십시오. 그들은 또한 모든 후즈과 표면을 살균해야합니다.
- 두 사람은 cannulation 테이블, 슬러쉬 기계, 소화 회로, 재관류 장치, COBE 정화 기계, 및 수술 테이블을 설정합니다.
- 동시에, 다른 두 팀 구성원은 격리하는 동안 필요한 미디어를 준비합니다.
- 다음 세균학 튜브 (병, 튜브, 형태 및 가방), 샘플링 튜브 (세척 사전 가득) 및 평가 튜브와 플레이트는 준비가되어 있습니다.
- 다음과 같이 설정 정화 튜브를 준비 : 제 1 관 빈 150 ML에 표시된 튜브 2-12 인간 알부민 (세척 용액)과 보충 M199 미디어 200 ML 가득 230 ML에 표시하고, 드디어 한 50 ML 원뿔 관 세척 솔루션 50 ML 가득. 일단 이러한 준비 단계 우리가 준비하고 췌장을 perfusing 시작할 준비가 완료됩니다.
2. 췌장 준비 및 재관류
- 준비와 췌장의 재관류를 시작하려면 연산자는 멸균 기술을 사용하여 패키지에서 장기를 제거합니다. 의사는 오염 제거 테이블에 췌장을 전송합니다.
- 외과 원래 췌장 보존 솔루션과 준비 "조달"세균학 병을 채우기 위해 그것을 사용합니다 운영자에게 손으로 그것을 하나의 60 ML의 주사기를 작성합니다.
- 장기가 아일릿 절연 (췌장이 조달하는 동안 손상이나 해부학적인 몸의 구조도 비정상적인 경우가 아일릿 절연을 위해 사용할 수 없습니다)에 적합 여부를 확인하는 육안 검사 후, 의사는 collagenase를 준비하는 연산자를 요청합니다. 저 다시 중단 시간이 서로 다른 효소 브랜드와 많은 사이 다릅니다 것을 기억하십시오.
- 외과 의사가 준비되면 오염 제거 테이블 (Betadine, Fungizone / Cefazolin하고 HBSS) 오염 제거 솔루션을 가지고 적절한 용기에 그들을 부어. 외과 의사는 잠시 오염 제거 솔루션의 각 췌장을 세척 췌장의 오염 제거를 수행합니다. 췌장은 다음이 무게 것입있는 작은 멸균 병에 배치됩니다. 무게가 배치 기록에 입력 후, 췌장 일부 보존 솔루션 cannulation의 냄비에 배치됩니다.
- 외과의 노출과 부분적으로 메인 덕트를 절개하고 정맥과 함께 췌장의 각 절반을 cannulate 것입니다. 정맥은 봉합에 의해 보안됩니다. 췌장을 perfuse하려면 먼저 재관류 단위로 이동하고 분지에 효소 솔루션을 부어. 총 재관류 시간은 5 분 동안 180 mmHg에서 다음 5 분 80 mmHg에서 약 10 분 거리에 있습니다. 췌장은 재관류 후 커지는.
- 지방 조직은 신중하게 췌장에서 손질되는 cannulation의 이동 perfused 췌장을 이동합니다. 다음 10-12 조각으로 췌장을 절감하고 소화에 대한 Ricordi 상공 회의소로 전송할 수 있습니다.
3. 췌장의 소화
- 소화 단계를 시작하려면, 빈 Ricordi 회의소로 췌장을 전송 화면에 넣어 Pulmozyme 중 하나를 2.5 ML의 약병을 (챔버를 조직 블록의 큰 덩어리를 방지) 추가 챔버를 닫고 시스템을 작성하십시오.
- 5 분 해결책을 펌핑 시작합니다. 부드럽게 골고루 따뜻한 솔루션을 걸쳐 해산하는 곳에는 바위. 5 분 후에, 부드럽게 전체 소화 단계에 대한 챔버를 흔들. 37 온도를 유지 ˚ C.
- 온도가 37 ° 후 챔버를 흔들어에 도달할 때까지 부드럽게 챔버 록. 샘플에게 2 분마다을 받아 무료로 아일 레츠이 범위 아래에서 발견될 경우 감지합니다. 배치 기록의 소화 테이블에 아일릿 평가 정보를 기록합니다. 그들의 50 %가 솔루션에 무료로 절연 부동있을 때까지 아일 레츠의 비율을 지속적으로 모니터.
4. 조직 모음
- 일단 아일 레츠의 50 %가 샘플 무료 발견, 소화는 회로의 차가운 RPMI 희석 솔루션을 추가하여 중지됩니다. 티슈 500 ML 원뿔 튜브 30 ML 인간 알부민과 함께 미리 채워진에 수집됩니다. 일단 튜브는 흡입이 뜨는에서, 버리고 차가운 씻어 솔루션으로 펠렛을 씻어 있습니다. 일분, 4 ˚ C. 위해 1100 RPM (분당 돌리기)에서 원뿔 튜브를 스핀
- 한 500 ML 원뿔로 소화 췌장 조직과 정지 모든 컬렉션 튜브를 결합합니다. 튜브 세차 조직 가득 차면, 분사 모든 조직은 여러 번 씻어 때까지 세척 과정을 반복합니다. 이 튜브를 회전하고 단일 250 ML 원뿔 관에 조직을 전송합니다. 250 ML까지를 볼륨을 가지고M199 세척 솔루션은 HA와 함께 보충 및 샘플링을위한 준비를합니다.
- 피펫과 1 ML 샘플을 가지고 씻어 솔루션 9 ML 사전 가득한 15 ML 원뿔 관에 추가할 수 있습니다. 그런 다음 그리드 계산 접시에 직접 1ml 밖으로 부드럽게 반전 15 ML 원뿔 관에 의해이에서 샘플을 섞는다. 세포를 카운트하고, 희석 요인 2500 (10x250)의를 사용하여 휴대폰 번호를 계산합니다.
- 250 ML 원뿔 튜브를 스핀과 UW (위스콘신 대학) 일반적으로 장기 보존을 위해 사용하는 솔루션 150 ML를 추가합니다. UW이 추가되면, 피펫을 사용하여 철저하게 세포 현탁액을 섞는다. UW의 시작 시간을 기록하고 정화 연산자로 통신합니다. 얼음 가끔 소용돌이에 튜브 (들)을 둡니다. 이제 아일 레츠는 더욱 정화 수 있습니다.
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Discussion
절연 결과 9,10 영향을 미치는 다양한 요소가 있습니다. 그 중에서도 췌장 조직의 소화는 현저한 역할을한다. 우리 자신의 인간 아일릿 절연 경험을 바탕으로, 우리는 잠재적으로 아일릿 수율과 품질에 영향을 미칠 수있는 중요한 포인트 아래와 요약.
- 효소의 종류가 활용되면 소화 시간이 다릅니다.
- 즉시 완전히 acinar 조직에서 분리 아일 레츠의 40~50%로 소화가 희석 솔루션을 추가하고 조직을 아래로 냉각하여 즉시 중단해야합니다.
- 조직의 부드러운 처리, 수집, 세탁, 그리고 혼합 때.
- 수집 조직 및 UW 솔루션의 조합은 더 나은 정화 결과를 얻기 위해서는 적어도 30 분 동안 얼음에 배치해야합니다.
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Acknowledgments
시카고 일리노이 대학뿐만 아니라 아일릿 세포 자원 센터 NIH 그랜트 (RFA - RR 05-003), 크리스토퍼 재단 Efroymson 재단과 Tellabs 재단에서 기금을 지원.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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