Summary
Lograr una alta calidad y la cantidad adecuada de islotes humanos es uno de los requisitos importantes para el trasplante de islotes exitosos. En este video se describe paso a paso los procedimientos para el aislamiento de los islotes pancreáticos humanos (I parte: la digestión y la acumulación de tejido de páncreas), utilizando un método modificado automatizado.
Abstract
Gestión de la diabetes tipo 1 es una carga, tanto para el individuo y la sociedad, con un costo de más de 100 millones de dólares anuales. A pesar del uso generalizado de la monitorización de la glucosa y las nuevas formulaciones de insulina, muchas personas aún se desarrollan devastadoras complicaciones secundarias. El trasplante de islotes pancreáticos puede restaurar un control casi normal a la glucosa en pacientes diabéticos
Protocol
1. Facilidad de configuración
- El aislamiento de islotes humanos es un procedimiento sensible al tiempo que implica el trabajo en equipo, y por lo tanto, cuatro personas se necesitan para llevar a cabo este procedimiento. El equipo está liderado por el cirujano, que disecciona y cannulates el páncreas.
- El aislamiento de islotes comienza en el momento que el equipo entra en la instalación de aislamiento de islotes UIC. Miembros del equipo de asegurarse de que todos los instrumentos necesarios, como la centrífuga, se comprueba y se enciende. También asegúrese de desinfectar todas las campanas y las superficies.
- Dos personas se creó la mesa de la canalización, máquina granizado, el circuito de la digestión, la unidad de la perfusión, la máquina de purificación de COBE, y mesas quirúrgicas.
- Al mismo tiempo, dos miembros del equipo preparará los medios de comunicación que se necesita durante el aislamiento.
- A continuación, los tubos de la bacteriología (botellas, tubos, la forma y la bolsa), los tubos de muestreo (pre-llenado con lavado), y los tubos de evaluación y las placas están preparadas.
- Prepare el tubo de depuración establecidos de la siguiente manera: El tubo de vacío y primera marca de 150 ml, tubos de 2.12 con 200 ml de M199 medios suplementados con albúmina humana (solución de lavado) y marcados con 230 ml y, finalmente, un tubo de 50 ml cónicos llena con 50 ml de solución de lavado. Una vez que estos pasos de preparación se completa estamos listos para empezar a preparar la perfusión y el páncreas.
2. Páncreas preparación y la perfusión
- Para comenzar la preparación y la perfusión del páncreas, un operario retira el órgano de los envases utilizando una técnica estéril. El cirujano de transferencia de páncreas a la mesa de la descontaminación.
- El cirujano llenar una jeringa de 60 ml con la solución de preservación de páncreas original y entregarlo a un operador, que se utiliza para rellenar preparado "Adquisiciones" botellas de bacteriología.
- Después de una inspección visual para determinar si el órgano es adecuado para el aislamiento de los islotes (Si el páncreas está dañado durante la adquisición o anormal anatómica, no se puede utilizar para el aislamiento de los islotes), el cirujano le preguntará al operador preparar la colagenasa. Recuerde que el tiempo que re-suspensión varía entre las marcas de enzimas diferentes y mucho.
- Cuando el cirujano está listo, poner las soluciones de descontaminación (Betadine, Fungizone / cefazolina y HBSS) a la mesa de la descontaminación y verter en los contenedores apropiados. Cirujano realiza la descontaminación del páncreas de lavado de un minuto, el páncreas en cada una de las soluciones de descontaminación. El páncreas se coloca en un pequeño frasco estéril en el que se pesaba. Después de que el peso se introduce en el registro del lote, el páncreas se coloca en la bandeja de la canalización con alguna solución de preservación.
- El cirujano exponer y cortar parcialmente el conducto principal y canular cada mitad del páncreas con una cánula. La cánula se asegura con sutura. Para la perfusión del páncreas, en primer lugar pasar a la unidad de la perfusión y se vierte la solución de la enzima en la cuenca. Tiempo de perfusión total es de unos 10 minutos, a 80 mmHg durante 5 minutos, luego a 180 mmHg durante 5 minutos. Páncreas distendido después de la perfusión.
- Mueva el páncreas perfundido a la sartén la canalización, donde se recorta el tejido graso del páncreas con cuidado. A continuación, corte el páncreas en 10-12 piezas y traslado a Ricordi Cámara para la digestión.
3. Páncreas digestión
- Para empezar a paso de digestión, el páncreas para la transferencia de la cámara de Ricordi vacía, añadir un 2,5 ml frasco de Pulmozyme, poner en la pantalla (evitar gran parte de bloque de tejido de la cámara), cerca de la cámara, y llenar el sistema.
- Comenzar a bombear la solución durante 5 minutos. Agite suavemente la cámara para dispersar uniformemente la solución caliente a través. Después de cinco minutos, agitar suavemente la cámara para la fase de digestión de todo. Mantener la temperatura a 37 ˚ C.
- Roca de la cámara suavemente hasta que la temperatura alcanza los 37 °, se sacude la cámara. Tomar una muestra cada dos minutos y detectar si islotes libres se encuentran bajo el ámbito de aplicación. Registrar la información de la evaluación de los islotes en la mesa de la digestión del registro del lote. Seguir para determinar el porcentaje de islotes hasta que haya un 50% de ellos flotando libremente y aislado en la solución.
4. Tejido colección
- Una vez que el 50% de los islotes se encuentran libres en las muestras, la digestión se detiene mediante la adición de una solución fría de dilución RPMI en el circuito. Tejido se recoge en 500 ml tubos cónicos precargada con 30 ml de albúmina humana. Una vez que los tubos se hacen girar, aspiración el sobrenadante y lavar el precipitado con solución de lavado en frío. Girar los tubos cónicos a 1100 RPM (revoluciones por minuto) durante 1 minuto, 4 ˚ C.
- Combine todos los tubos de recogida de suspensión de tejido pancreático digieren en un solo cónico de 500 ml. Cuando el tubo está lleno de tejido lavado, centrifugado y repita el proceso de lavado hasta que todo el tejido ha sido lavada varias veces. Girar el tubo y la transferencia de los tejidos en un solo tubo de 250 ml cónico. Llevar el volumen hasta 250 ml conM199 solución de lavado suplementado con HA y prepararse para el muestreo.
- Tomar una muestra de 1 ml con una pipeta y se añade a un tubo cónico de 15 ml precargada con 9 ml de solución de lavado. A continuación, mezclar suavemente invirtiendo el tubo cónico de 15 ml y de esto, la muestra de 1 ml directamente en una placa de red de conteo. Contar las células, y calcular el número de células con un factor de dilución de 2500 (10x250).
- Girar el tubo de 250 ml y añadir 150 ml de la Universidad de Washington (Universidad de Wisconsin), solución que suele utilizar para la preservación de órganos. Cuando la Universidad de Washington, se añade, mezcla de la suspensión celular a fondo con la pipeta. Registrar y comunicar al operador de la purificación, el tiempo de inicio en la Universidad de Washington. Deje el tubo (s) en el hielo y agitar de vez en cuando. Ahora los islotes se pueden purificar aún más.
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Discussion
Hay una variedad de factores que afectan el resultado de aislamiento 9,10. Entre ellos, la digestión del tejido pancreático desempeña un papel destacado. Con base en nuestra propia experiencia humana aislamiento de islotes, se resumieron los siguientes puntos críticos, que podrían influir en el rendimiento y la calidad de los islotes.
- El tiempo de digestión es diferente cuando los diferentes tipos de enzimas que se utilizan.
- Tan pronto como el 40-50% de los islotes completamente separados del tejido acinar, la digestión se debe suspender de inmediato mediante la adición de solución de dilución y el enfriamiento del tejido.
- Un manejo cuidadoso de los tejidos en la recogida, lavado, y la mezcla.
- La mezcla de tejidos recogidos y la solución UW se debe colocar en hielo durante al menos 30 minutos con el fin de obtener mejores resultados de depuración.
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Acknowledgments
Apoyado con fondos de la Universidad de Illinois en Chicago, así como células de los islotes del Centro de Recursos NIH (RFA-05-003 RR), la Fundación Christopher, la Fundación Efroymson, y la Fundación Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
