Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel

doi: 10.3791/1125 Published: May 26, 2009

Summary

Het bereiken van hoge kwaliteit en de juiste hoeveelheid van de menselijke eilandjes is een van de prominente voorwaarden voor een succesvolle transplantatie eilandjes van Langerhans. In deze video, beschrijven we stap voor stap de procedures voor de menselijke eilandjes van Langerhans isolatie (deel I: de spijsvertering en het verzamelen van de pancreas weefsel) met behulp van een aangepaste automatische methode.

Abstract

Het beheer van type 1 diabetes is belastend, zowel voor het individu en de samenleving, voor meer dan 100 miljard dollar per jaar. Ondanks het wijdverbreide gebruik van glucose monitoring en nieuwe insuline-formuleringen, veel mensen nog steeds te ontwikkelen verwoestende secundaire complicaties. Eilandjes van Langerhans transplantatie kan herstellen in de buurt van normale glucose-controle bij patiënten met diabetes

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Facility setup

  1. Human eilandje isolatie is een tijd gevoelig procedure die teamwork meebrengt, en dus vier personen nodig zijn om deze procedure te voeren. Het team wordt geleid door de chirurg, die ontleedt en cannulates de alvleesklier.
  2. Het eilandje isolatie begint de minuut van het team komt in de UIC eilandje isolatie faciliteit. De teamleden zorgen dat alle nodige instrumenten, zoals de centrifuge, wordt gecontroleerd en is ingeschakeld. Ze zorgen er ook voor alle kappen en oppervlakken te ontsmetten.
  3. Twee mensen zullen het opzetten van de cannulatie tafel, slush machine, de spijsvertering circuit, perfusie-eenheid, COBE zuivering machine, en chirurgische tabellen.
  4. Tegelijkertijd zullen twee andere teamleden de voorbereiding van de media die nodig zijn tijdens isolatie.
  5. Vervolgens worden bacteriologie buizen (flessen, buizen, vorm en tas), monstername buizen (pre-gevuld met wassen), en beoordeling buizen en platen voorbereid.
  6. De voorbereiding van de zuivering buis als volgt: De 1e tube leeg en gemarkeerd op 150 ml, buizen 2-12 gevuld met 200 ml van de M199 media aangevuld met humaan albumine (wassen oplossing) en gemarkeerd op 230 ml, en tenslotte een 50 ml conische buis gevuld met 50 ml wasoplossing. Eens deze voorbereidende stappen zijn voltooid zijn we klaar om te beginnen met het voorbereiden en perfuseren de alvleesklier.

2. Pancreas voorbereiding en perfusie

  1. Om te beginnen de voorbereiding en perfusie van de alvleesklier, een operateur verwijdert het orgel van de verpakking met behulp van steriele techniek. De chirurg zal overdracht van de alvleesklier naar de sanering tafel.
  2. De chirurg vult een 60 ml spuit met de originele alvleesklier behoud oplossing en geef het aan een exploitant, die zal gebruiken om voorbereid "Procurement" bacteriologie flessen te vullen.
  3. Na een visuele inspectie om te bepalen of het orgaan geschikt is voor eilandje isolatie (Als de alvleesklier is beschadigd Tijdens de verkrijging of anatomisch abnormaal is, kan het niet worden gebruikt voor eilandje isolatie), zal de chirurg te vragen een operator om collagenase te bereiden. Vergeet niet dat dat het opnieuw schorsing varieert tussen verschillende enzym merken en kavels.
  4. Als de chirurg klaar is, brengen de sanering oplossingen (Betadine, fungizone / Cefazolin en HBSS) om de sanering tafel en giet ze in de daarvoor bestemde containers. Chirurg voert pancreas decontaminatie wassen voor een minuut de alvleesklier in elk van de decontaminatie-oplossing. De alvleesklier wordt dan geplaatst in een klein steriel potje waarin het zal worden gewogen. Nadat het gewicht is ingevoerd in de batch-record, wordt de alvleesklier geplaatst in de cannulatie pan met wat behoud oplossing.
  5. De chirurg zal blootstellen en gedeeltelijk incise de belangrijkste kanaal en canule elke helft van de alvleesklier met een canule. De canule wordt gewaarborgd door hechtdraad. Om perfuseren de alvleesklier, eerste stap naar de perfusie-eenheid en giet het enzym oplossing in het bekken. Totale perfusie is ongeveer 10 minuten, bij 80 mmHg gedurende 5 minuten, daarna op 180 mmHg gedurende 5 minuten. Pancreas opgezwollen na perfusie.
  6. Verplaats de perfusie alvleesklier naar de cannulatie pan, waar het vetweefsel wordt getrimd voorzichtig uit de alvleesklier. Knip dan de alvleesklier in 10-12 stukken en over te dragen aan Ricordi Kamer voor de spijsvertering.

3. Pancreas spijsvertering

  1. Om te beginnen de spijsvertering stap, de overdracht van de alvleesklier naar de lege kamer Ricordi, voeg een 2,5 ml flacon van Pulmozyme, zet op het scherm (vermijd grote brok van weefsel blok de kamer), sluit de kamer, en vullen van het systeem.
  2. Start het overpompen van de oplossing gedurende 5 minuten. Schud de kamer gelijkmatig te verspreiden in heel warme oplossing. Na vijf minuten, schud de kamer voor de gehele spijsvertering fase. Handhaaf de temperatuur op 37 ˚ C.
  3. Schud de kamer totdat de temperatuur bereikt 37 °, dan schud de kamer. Neem een ​​monster om de twee minuten detecteren of gratis eilandjes zijn te vinden onder het toepassingsgebied. Noteer het eilandje evaluatie-informatie bij de vertering tabel van de partij vast te leggen. Blijf het percentage van de eilandjes te controleren tot er 50% van hen zweven vrij en geïsoleerd in de oplossing.

4. Tissue collectie

  1. Zodra 50% van de eilandjes zijn te vinden vrij in de monsters, wordt de spijsvertering gestopt door toevoeging van koude RPMI verdunningsoplossing in het circuit. Weefsel wordt verzameld in 500 ml conische buizen voorgevuld met 30 ml humaan albumine. Nadat de buizen zijn gesponnen, zuig uit de bovendrijvende en was het pellet met koud wassen oplossing. Spin de conische buizen op 1100 RPM (rotaties per minuut) gedurende 1 minuut, 4 ˚ C.
  2. Combineer de hele verzameling buizen opgehangen met verteerde pancreas weefsel in een 500 ml konische. Wanneer een buis vol met gewassen weefsel, spin en herhaal het wasproces tot alle weefsel is gewassen meerdere keren. Spin deze buis en breng het weefsel in een 250 ml conische buis. Breng het volume tot 250 ml metM199 wasoplossing aangevuld met HA en voor te bereiden voor de bemonstering.
  3. Neem een ​​1 ml monster met een pipet en toe te voegen aan een 15 ml conische buizen pre-gevuld met 9 ml wasoplossing. Meng vervolgens door voorzichtig omkeren van de 15 ml conische buis en uit deze, monster uit 1 ml direct in een rooster tellen schotel. Tellen van de cellen, en bereken het aantal cellen met behulp van een verdunningsfactor van 2500 (10x250).
  4. Spin de 250 ml conische buis en voeg 150 ml van UW (Universiteit van Wisconsin) oplossing die meestal gebruikt voor orgel bewaring. Wanneer UW wordt toegevoegd, meng grondig de celsuspensie met behulp van de pipet. Opnemen en aan de zuivering operator de starttijd in UW. Laat de tube (s) op ijs en swirl af en toe. Nu de eilandjes kan verder worden gezuiverd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Er zijn verschillende factoren die van invloed de isolatie uitkomst 9,10. Onder hen, de spijsvertering van de pancreas weefsel speelt een prominente rol. Op basis van onze eigen menselijke eilandje isolatie ervaren, hebben we samengevat volgende kritische punten, die mogelijk invloed hebben op de eilandje opbrengst en kwaliteit.

  1. De spijsvertering is anders wanneer verschillende soorten enzymen worden gebruikt.
  2. Zodra 40-50% van de eilandjes volledig gescheiden van acinaire weefsel, moet de spijsvertering onmiddellijk worden gestopt door toevoeging van verdunning oplossing en het afkoelen van de weefsel.
  3. Voorzichtige behandeling van het weefsel bij het verzamelen, wassen en mengen.
  4. Het mengsel van de verzamelde weefsel en UW oplossing moet worden gelegd op ijs gedurende minstens 30 minuten om een ​​betere zuivering resultaat te verkrijgen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Ondersteund door de financiering van de Universiteit van Illinois in Chicago als Islet Cell Resource Center NIH-subsidie ​​(RFA-RR 05-003), de Christopher Foundation, de Efroymson Foundation, en de Tellabs Foundation.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
Human eilandjes van Langerhans Isolatie: Deel I: Spijsvertering en verzameling van alvleesklierweefsel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).More

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter