Summary
Il raggiungimento di alta qualità e la quantità appropriata di isole umane è uno dei presupposti importanti per il trapianto di isole pancreatiche di successo. In questo video, si descrive passo dopo passo le procedure per l'isolamento delle isole pancreatiche umane (I parte: la digestione e la raccolta di tessuto pancreatico) utilizzando un metodo modificato automatizzato.
Abstract
Gestione del diabete di tipo 1 è onerosa, sia per l'individuo e la società, che costano oltre 100 miliardi di dollari all'anno. Nonostante l'uso diffuso di monitoraggio della glicemia e insulina formulazioni nuove, molte persone ancora sviluppare devastanti complicanze secondarie. Trapianto di isole pancreatiche in grado di ripristinare nei pressi di controllo normale del glucosio in pazienti diabetici
Protocol
1. Programma di setup
- Isolamento isole umane è una procedura momento delicato che coinvolge il lavoro di squadra e, quindi, quattro individui sono necessarie per condurre questa procedura. Il team è guidato dal chirurgo, che analizza e cannulates il pancreas.
- L'isolamento delle isole inizia il minuto la squadra entra nel UIC di isolamento delle isole. I membri del team in modo che tutta la strumentazione necessaria, come la centrifuga, viene controllata e acceso. Inoltre assicuratevi di disinfettare tutte le cappe e superfici.
- Due persone si impostare la tabella incannulazione, granitore, circuito digestione, unità di perfusione, macchina purificazione COBE, e tavoli operatori.
- Contemporaneamente, due altri membri del team si preparano i mezzi di comunicazione che è necessario durante l'isolamento.
- Avanti, tubi batteriologia (bottiglie, tubi, la forma e la borsa), tubi di campionamento (pre-riempite con lavaggio), e tubi di valutazione e piatti sono preparati.
- Preparate il tubo di purificazione impostata come segue: Il 1 ° tubo vuoto e segnato a 150 ml, tubi 2-12 riempito con 200 ml di M199 mezzi di comunicazione integrata con albumina umana (soluzione di lavaggio) e segnato a 230 ml, e infine un tubo da 50 ml riempito con 50 ml di soluzione di lavaggio. Una volta che questi passaggi di preparazione sono completi siamo pronti per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas.
2. Pancreas preparazione e perfusione
- Per iniziare la preparazione e la perfusione del pancreas, un operatore rimuove l'organo dalla confezione utilizzando una tecnica sterile. Il chirurgo trasferirà il pancreas al tavolo di decontaminazione.
- Il chirurgo riempire una siringa da 60 ml con la soluzione originale preservazione del pancreas e consegnarla ad un operatore, che lo utilizzano per riempire preparato "Procurement" bottiglie di batteriologia.
- Dopo un controllo visivo per stabilire se l'organo è adatto per l'isolamento delle isole (Se il pancreas viene danneggiato durante il prelievo o anatomicamente anomali, che non possono essere utilizzati per l'isolamento delle isole), il chirurgo dovrà chiedere a un operatore per preparare collagenasi. Ricorda che tale ri-sospensione del tempo varia tra i marchi di enzimi diversi e molto.
- Quando il chirurgo è pronto, portare le soluzioni di decontaminazione (Betadine, Fungizone / Cefazolina e HBSS) alla tabella di decontaminazione e versarli in appositi contenitori. Chirurgo esegue decontaminazione pancreas lavaggio per un minuto il pancreas in ciascuna delle soluzioni di decontaminazione. Il pancreas viene quindi posto in un vasetto sterile in cui sarà pesato. Dopo che il peso è entrato nel batch record, il pancreas viene posizionato in padella con un po cannulazione soluzione di conservazione.
- Il chirurgo esporre e parzialmente incidere il condotto principale e cannulate ogni metà del pancreas con una cannula. La cannula viene garantito da sutura. Per profumato il pancreas, prima spostare l'unità perfusione e versare la soluzione enzimatica nel bacino. Perfusione tempo totale è di circa 10 minuti, a 80 mmHg per 5 minuti, poi a 180 mmHg per 5 minuti. Pancreas disteso dopo la perfusione.
- Spostare il pancreas perfuso alla padella incannulazione, dove viene tagliato il tessuto adiposo dal pancreas con attenzione. Poi tagliare il pancreas in 10-12 pezzi e trasferimento a Ricordi Camera per la digestione.
3. Pancreas digestione
- Per iniziare la fase di digestione, il pancreas trasferimento alla Camera vuota Ricordi, aggiungere una fiala 2,5 ml di Pulmozyme, mettere sullo schermo (evitare grossa fetta del blocco tessuto della camera), chiudere la camera, e riempire il sistema.
- Iniziare a pompare la soluzione per 5 minuti. Agitare delicatamente la camera a disperdersi uniformemente soluzione calda per tutto. Dopo cinque minuti, agitare delicatamente la camera per la fase di digestione intero. Mantenere la temperatura a 37 ˚ C.
- Rock the camera delicatamente fino a quando la temperatura raggiunge i 37 °, poi scuotere la camera. Prelevare un campione ogni due minuti e rilevare se isolotti liberi si trovano nel campo d'applicazione. Registrare le informazioni isolotto di valutazione nella tabella digestione dei batch record. Continuerà a monitorare la percentuale di isolotti finché non ci sono il 50% di loro flottante libero e isolato nella soluzione.
4. Raccolta dei tessuti
- Una volta che il 50% delle isole si trovano liberi nei campioni, la digestione viene interrotta con l'aggiunta di freddo soluzione di diluizione RPMI nel circuito. Tessuto viene raccolto in 500 ml provette coniche pre-riempite con 30 ml di albumina umana. Una volta che i tubi sono filata, aspirazione fuori dal surnatante e lavare il pellet con la soluzione di lavaggio a freddo. Gira i tubi conici a 1100 RPM (rotazioni al minuto) per 1 minuto, 4 ˚ C.
- Combina tutti i tubi di raccolta sospesa con tessuto pancreatico digeriti in un singolo da 500 ml. Quando un tubo è pieno di tessuto lavato, girare e ripetere il processo di lavaggio fino a tutto il tessuto è stato lavato più volte. Spin questo tubo e trasferire il tessuto in un unico tubetto da 250 ml. Portare il volume fino a 250 ml conM199 soluzione di lavaggio integrato con HA e prepararsi per il campionamento.
- Prendete un campione di 1 ml con una pipetta e aggiungere in una provetta da 15 ml conica pre-riempita con 9 ml di soluzione di lavaggio. Quindi mescolare delicatamente invertendo il tubo da 15 ml e da questa, campione fuori 1ml direttamente in un piatto della griglia di conteggio. Contare le celle, e calcolare il numero di cellulare utilizzando un fattore di diluizione del 2500 (10x250).
- Spin il tubetto da 250 ml conica e aggiungere 150 ml di UW (Università del Wisconsin), soluzione che di solito uso per la conservazione degli organi. Quando UW si aggiunge, mescolare la sospensione cellulare accuratamente con la pipetta. Registrare e comunicare all'operatore purificazione l'ora di inizio di UW. Lasciare il tubo (s) su ghiaccio e agitare di tanto in tanto. Ora le isole possono essere ulteriormente purificato.
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Discussion
Ci sono una varietà di fattori che influenzano il risultato dell'isolamento 9,10. Tra questi, la digestione del tessuto pancreatico gioca un ruolo di primo piano. Sulla base della nostra esperienza umana isolamento delle isole, abbiamo riassunto i seguenti punti critici, che potrebbe potenzialmente influenzare il rendimento delle isole e la qualità.
- Il tempo di digestione è diversa quando i diversi tipi di enzimi sono utilizzati.
- Non appena il 40-50% delle isole completamente separate dal tessuto acinari, la digestione deve essere immediatamente interrotta con l'aggiunta di soluzione di diluizione e il raffreddamento del tessuto.
- Trattamento delicato dei tessuti al momento del ritiro, il lavaggio, e la miscelazione.
- La miscela di tessuti raccolti e la soluzione UW dovrebbe essere messo in ghiaccio per almeno 30 minuti al fine di ottenere risultato migliore purificazione.
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Acknowledgments
Supportato da un finanziamento della University of Illinois a Chicago, nonché delle cellule delle isole Resource Center NIH di sovvenzione (RFA-RR 05-003), la Fondazione Cristoforo, la Fondazione Efroymson, e la Fondazione Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
