Summary
Atteindre de haute qualité et la quantité appropriée d'îlots humains est l'une des conditions préalables importantes pour la transplantation d'îlots de succès. Dans cette vidéo, nous décrire étape par étape les procédures pour l'isolement des îlots pancréatiques humains (partie I: la digestion et la collecte des tissus pancréatiques) en utilisant une méthode modifiée automatisés.
Abstract
Gestion diabète de type 1 est lourde, tant pour l'individu et la société, ce qui coûte plus de 100 milliards de dollars annuellement. Malgré l'utilisation répandue de la surveillance du glucose et des préparations d'insuline nouvelles, de nombreuses personnes encore développer des complications secondaires dévastateurs. Transplantation d'îlots pancréatiques peut restaurer à proximité de contrôle de la glycémie normale chez les patients diabétiques
Protocol
1. Facilité de configuration
- L'isolement des îlots humains est une procédure qui implique le temps sensible équipe, et donc, quatre personnes sont nécessaires pour mener à bien cette procédure. L'équipe est dirigée par le chirurgien, qui dissèque et cannulates le pancréas.
- L'isolement des îlots commence à la minute de l'équipe entre dans l'installation des îlots UIC isolement. Membres de l'équipe d'assurer que tous les instruments nécessaires, comme la centrifugeuse, est vérifié et mis sous tension. Ils s'assurent aussi de désinfecter toutes les hottes et les surfaces.
- Deux personnes seront mis en place la table de canulation, machine à neige fondante, circuit de la digestion, l'unité de perfusion, la machine de purification COBE, et les tables chirurgicales.
- Simultanément, deux autres membres d'équipe va préparer le support qui est nécessaire lors de l'isolement.
- Ensuite, les tubes de bactériologie (bouteilles, tubes, la forme et le sac), des tubes de prélèvement (pré-rempli avec de lavage), et les tubes et les plaques d'évaluation sont préparés.
- Préparer le tube de purification fixés comme suit: Le 1er tube vide et marqué à 150 ml, tubes remplis 2-12 avec 200 ml d'M199 milieux supplémentés avec de l'albumine humaine (solution de lavage) et marqué à 230 ml, et enfin un tube conique de 50 ml remplie avec 50 ml de solution de lavage. Une fois ces étapes de préparation sont complets, nous sommes prêts à commencer la préparation et la perfusion du pancréas.
2. La préparation du pancréas et de la perfusion
- Pour commencer la préparation et la perfusion du pancréas, un opérateur enlève l'organe de l'emballage en utilisant une technique stérile. Le chirurgien va transférer le pancréas à la table de décontamination.
- Le chirurgien va remplir une seringue de 60 ml avec la solution de préservation du pancréas d'origine et le remettre à un opérateur qui va l'utiliser pour remplir des bouteilles préparées "achats" bactériologie.
- Après une inspection visuelle pour déterminer si l'organe est approprié pour l'isolement des îlots (Si le pancréas est endommagé au cours d'achat ou anatomique anormale, il ne peut être utilisé pour l'isolement des îlots), le chirurgien va demander à un opérateur pour préparer la collagénase. Rappelez-vous que ce temps de remise en suspension varie entre marques différentes enzymes et des lots.
- Lorsque le chirurgien est prêt, apporter les solutions de décontamination (Betadine, Fungizone / céfazoline et HBSS) à la table de décontamination et les verser dans les contenants appropriés. Chirurgien effectue la décontamination du pancréas à laver pendant une minute le pancréas dans chacune des solutions de décontamination. Le pancréas est ensuite placé dans un petit bocal stérile dans lequel il sera pesé. Après le poids est entré dans le dossier de lot, le pancréas est placé dans la poêle avec quelques canulation solution de conservation.
- Le chirurgien va exposer et partiellement inciser le conduit principal et cathétériser chaque moitié du pancréas avec une canule. La canule sera garanti par une suture. Pour perfuser le pancréas, d'abord de le déplacer à l'unité de la perfusion et versez la solution enzymatique dans le bassin. Temps de perfusion totale est d'environ 10 minutes, à 80 mmHg pendant 5 minutes, puis à 180 mm Hg pendant 5 minutes. Pancréas distendus après la perfusion.
- Déplacer le pancréas perfusé à la casserole canulation, où le tissu adipeux est coupé par le pancréas attentivement. Ensuite, couper le pancréas en 10-12 morceaux et transfert à Ricordi Chambre pour la digestion.
3. La digestion du pancréas
- Pour commencer étape de digestion, le transfert du pancréas à la chambre vide Ricordi, ajouter un flacon de 2,5 ml de Pulmozyme, mis à l'écran (éviter les gros morceau de bloc de tissu dans la chambre), à proximité de la chambre, et remplissez le système.
- Commencer à pomper la solution pendant 5 minutes. Secouez doucement la chambre pour mieux répartir la solution chaude partout. Après cinq minutes, secouez doucement la chambre pour la phase de digestion ensemble. Maintenir la température à 37 ˚ C.
- Rocher de la chambre doucement jusqu'à ce que la température atteint 37 °, puis secouez la chambre. Prendre un échantillon toutes les deux minutes et de détecter si îlots libres se trouvent sous la portée. Enregistrer les informations d'évaluation des îlots dans le tableau de digestion du dossier de lot. Continuer à surveiller le pourcentage d'îlots jusqu'à il ya 50% d'entre eux flottent librement et isolées dans la solution.
4. Collection de tissus
- Une fois que 50% des îlots se trouvent libres dans les échantillons, la digestion est arrêtée en ajoutant une solution froide de dilution RPMI dans le circuit. Tissulaire est recueilli dans 500 ml tubes coniques pré-rempli avec 30 ml d'albumine humaine. Une fois les tubes sont filées, aspiration le surnageant et laver le culot avec la solution de lavage à froid. Faites tourner les tubes coniques à 1100 RPM (tours par minute) pendant 1 minute, 4 ˚ C.
- Combiner tous les tubes de prélèvement suspendu avec du tissu pancréatique digère en une seule conique de 500 ml. Lorsqu'un tube est plein de tissus lavés, spin et répétez le processus de lavage jusqu'à ce que tous les tissus ont été lavés plusieurs fois. Spin ce tube et le transfert des tissus dans un seul tube conique de 250 ml. Porter le volume à 250 ml avecM199 solution de lavage complété avec HA et se préparer pour l'échantillonnage.
- Prenez un échantillon de 1 ml avec une pipette et ajouter à un tube de 15 ml conique pré-rempli avec 9 ml de solution de lavage. Puis mélanger doucement en inversant le tube de 15 ml conique et de cela, l'échantillon à 1 ml directement dans un plat grille de comptage. Compter les cellules, et calculer le nombre de cellules en utilisant un facteur de dilution de 2500 (10x250).
- Spin le tube conique de 250 ml et ajouter 150 ml d'UW (Université du Wisconsin) Solution qui sert d'ordinaire pour la préservation des organes. Lorsque l'UW est ajouté, mélanger la suspension cellulaire à fond à l'aide de la pipette. Enregistrer et communiquer à l'opérateur de purification de l'heure de début dans l'UW. Laisser le tube (s) sur la glace et agiter de temps en temps. Maintenant, les îlots peuvent être purifié davantage.
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Discussion
Il existe une variété de facteurs influant sur le résultat 9,10 isolement. Parmi eux, la digestion du tissu pancréatique joue un rôle de premier plan. Basé sur notre propre expérience d'isolement d'îlots humains, nous avons résumé ci-après les points critiques, qui pourraient potentiellement influencer le rendement de l'îlot et de qualité.
- Le temps de digestion est différente lorsque les différents types d'enzymes sont utilisés.
- Dès que 40-50% des îlots complètement séparé du tissu acineux, la digestion doit être arrêté immédiatement en ajoutant une solution de dilution et de refroidissement des tissus.
- Manipulation en douceur des tissus lors de la collecte, le lavage, et le mixage.
- Le mélange des tissus prélevés et la solution UW doit être placé sur la glace pendant au moins 30 minutes afin d'obtenir meilleur résultat de purification.
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Acknowledgments
Soutenu par un financement de l'Université de l'Illinois à Chicago ainsi que des cellules des îlots Resource Center NIH (RFA-05-003 RR), la Fondation Christopher, la Fondation Efroymson, et la Fondation Tellabs.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
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