Summary
Uppnå hög kvalitet och lämplig mängd mänskliga skär är en av de framstående förutsättningarna för en framgångsrik ö-transplantation. I denna video beskriver vi steg för steg förfarandena för mänskliga bukspottkörteln holme isolering (del I: matsmältningen och samling av bukspottskörteln vävnad) med hjälp av en modifierad automatiserad metod.
Abstract
Hantering av typ 1 diabetes är betungande, både för individen och samhället, kostar över 100 miljarder dollar årligen. Trots den utbredda användningen av glukos övervakning och nya formuleringar insulin, många individer utvecklar fortfarande förödande sekundära komplikationer. Pankreas ö-transplantation kan återställa nära normal blodsockerkontroll hos diabetespatienter
Protocol
1. Facility installation
- Mänskliga holme isolering är en känslig tid förfarande som innebär lagarbete, och därmed är fyra personer som behövs för detta förfarande. Teamet leds av kirurgen, som dissekerar och cannulates bukspottkörteln.
- Den holme isolering börjar minut laget kommer in i UIC anläggningen holme isolering. Gruppmedlemmarna säkerställa att alla nödvändiga instrument, liksom centrifug, kontrolleras och påslagen. De ser också till att sanera alla huvor och ytor.
- Två personer kommer att ställa in kanylering bordet, slask maskin, matsmältning krets, perfusion enhet, COBE rening maskin, och operationsbord.
- Samtidigt kommer två andra gruppmedlemmar förbereda media som behövs vid isolering.
- Vidare är bakteriologi tuber (flaskor, rör, form och väska), rör provtagning (förfyllda med tvätt), och rör bedömning och plattor förberedd.
- Förbered rening röret enligt följande: Den 1: a röret tomma och markerade på 150 ml, rör 2-12 fylld med 200 ml M199 media kompletteras med humant albumin (tvättlösning) och markeras på 230 ml, och slutligen en 50 ml koniska rör fylld med 50 ml tvättlösning. När dessa förberedelser steg är klara är vi redo att börja förbereda och perfusing bukspottkörteln.
2. Bukspottkörteln beredning och perfusion
- Till att börja förbereda och perfusion i bukspottkörteln, tar bort en operatör orgeln från förpackningar med steril teknik. Kirurgen kommer att överföra bukspottkörteln till sanering bordet.
- Kirurgen kommer att fylla en 60 ml spruta med den ursprungliga bukspottkörteln bevara lösning och lämna det till en operatör, som kommer att använda den för att fylla förberedda "upphandling" bakteriologi flaskor.
- Efter en okulär besiktning för att avgöra om orgeln är lämplig för holme isolering (Om bukspottkörteln skadas under upphandling eller anatomiskt onormala, kan det inte användas för holme isolering), kommer kirurgen be operatören att förbereda kollagenas. Kom ihåg att det resuspension varierar mellan olika enzym märken och partier.
- När kirurgen är klar, ta med sanering lösningar (Betadine, Fungizone / Cefazolin och HBSS) till sanering bordet och häll dem i lämpliga behållare. Kirurgen utför bukspottkörteln sanering tvätt för en minut bukspottkörteln i varje sanering lösningen. Bukspottkörteln placeras sedan i en liten steril burk där det kommer att vägas. När vikten är in i satsposten är bukspottkörteln placeras i kanylering pannan med några bevarande lösning.
- Kirurgen kommer att avslöja och delvis incisionsfilm de viktigaste kanal och cannulate varje halva i bukspottkörteln med en kanyl. Kanylen kommer att säkras genom sutur. För att BEGJUTA bukspottkörteln, först flytta den till perfusion enheten och häll enzymet lösningen i bassängen. Totalt perfusionen tar cirka 10 minuter, vid 80 mmHg i 5 minuter, därefter på 180 mmHg i 5 minuter. Bukspottkörteln utspänd efter perfusion.
- Flytta perfusion bukspottkörteln till kanylering panorera, där fettvävnad har trimmats från bukspottkörteln noggrant. Skär den sedan i bukspottkörteln i 10-12 bitar och överföring till Ricordi avdelningen för matsmältningen.
3. Bukspottkörteln matsmältningen
- Till att börja matsmältningen steget, överföring bukspottkörteln till den tomma Ricordi avdelningen, lägga till en 2,5 ml injektionsflaska av Pulmozyme, sätt på skärmen (undvik stor bit av vävnad blockera avdelningen) Stäng kammaren, och fyll upp systemet.
- Börja pumpa lösningen i 5 minuter. Skaka kammaren till jämnt fördela varma lösningen hela. Efter fem minuter, försiktigt skaka kammaren för hela matsmältningen fas. Hålla temperaturen vid 37 ˚ C.
- Rock kammaren försiktigt tills temperaturen når 37 °, sedan skaka kammaren. Ta ett prov varannan minut och upptäcka om fri holmar finns under tillämpningsområdet. Anteckna holmen utvärdering information i matsmältningen tabellen av partiet posten. Fortsätta att övervaka andelen holmar tills det är 50% av dem flyta upp fritt och isolerade i lösningen.
4. Tissue samlingen
- När 50% av holmarna finns gratis i proverna, är matsmältningen stoppas genom tillsats av kallt RPMI utspädning lösning i kretsen. Tissue samlas i 500 ml koniska rör förfylld med 30 ml humant albumin. När rören är spunnen, av supernatanten avsugning och skölj pellets med kallt tvättlösning. Snurra koniska rör vid 1100 rpm (varv per minut) under 1 minut, 4 ˚ C.
- Kombinera alla Uppsamlingsrör avbrytas med smält pankreas vävnad till en enda 500 ml konisk. Om ett rör är full av tvättade vävnad, snurra och tvätta på processen tills alla vävnad har tvättats flera gånger. Spin detta rör och överför vävnaden till en enda 250 ml E-rör. Ta upp volymen till 250 ml medM199 tvättlösningen kompletteras med HA och förbereda sig för provtagning.
- Tag en 1 ml prov med en pipett och lägg till ett 15 ml koniskt rör förfyllda med 9 ml tvättlösning. Blanda sedan genom att försiktigt vända på 15 ml koniska rör och från detta prov ut 1ml direkt i ett rutnät räknar maträtt. Räkna celler och beräkna antal celler med hjälp av en utspädningsfaktor 2500 (10x250).
- Snurra 250 ml konisk tub och tillsätt 150 ml UW (University of Wisconsin) Lösning som vanligtvis används för orgel bevarande. När UW tillsätts, blanda cellsuspensionen grundligt med hjälp av pipetten. Spela in och meddela rening operatören starttiden i UW. Låt röret (s) på is och skaka då och då. Nu holmar kan renas ytterligare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns en mängd olika faktorer som påverkar isoleringen resultatet 9,10. Bland dem spelar nedbrytning av bukspottkörtelns vävnad en framträdande roll. Baserat på våra egna mänskliga holme isolering erfarenhet, vi sammanfatta följande kritiska punkter, som skulle kunna påverka holmen avkastning och kvalitet.
- Den koktiden är olika när olika typer av enzymer utnyttjas.
- Så snart som 40-50% av de holmar helt skild från acinar vävnad, bör matsmältningen stoppas omedelbart genom att lägga till spädning lösning och nedkylning av vävnad.
- Skonsam hantering av vävnaden vid insamling, tvätt, och mixning.
- Blandningen av insamlade vävnad och UW-lösning bör läggas på is i minst 30 minuter för att få bättre rening resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av medel från University of Illinois i Chicago samt Islet Cell Resource Center NIH bidrag (RFA-RR 05-003), den Christopher Foundation, Efroymson Foundation och Tellabs stiftelsen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Ice Slush Machine | equipment | Taylor Company | K4036546 | make sterile ice |
| Centrifuge | equipment | Beckman Coulter Inc. | 424803 | |
| MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 | equipment | Leica Microsystems | 4103 | |
| Cell Culture Dish with 2 mm Grid | equipment | Nalge Nunc international | 174926 | islet counting |
| Digital Water Bath EX7 | equipment | NesLab | 105361058 | |
| Thermometer | equipment | IBI:IR | 60444 | |
| MonoBloc Balance AB 104-S | equipment | Mettler Toledo | 1119430864 | measure pancreas weight |
| MasterFlex II Speed Controller | equipment | Cole-Parmer | J00006445 | adjust flow speed during degestion |
| Digital Sight DS L1 | equipment | Nikon Instruments | 217267 | |
| Perfusion Unit | equipment | Custom Made | n/a | |
| Cooler for perfusion unit | equipment | Fisher Scientific | 3013P | |
| Ricordi Chamber | equipment | University of Miami | n/a | |
| RPMI dilution solution | reagent | Mediatech, Inc. | 99783024 | |
| University of Wisconcin (UW) solution | reagent | DURAMED | 1000-46-06 | |
| Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-597-CM | |
| 25% Human Albumin | reagent | GRIFOLS | NDC 61953-0002-2 | |
| M199 media (wash solution) | reagent | Mediatech, Inc. | 99-784-CM | |
| Collagenase NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002937 | |
| Neutral Protease NB1 GMP grade | reagent | SERVA Electrophoresis | N0002936 | |
| Betadine | reagent | Cardinal Health | 29906-004 | |
| Cefazolin | reagent | West-Ward Pharmaceutical | NDC 0143-9924-90 | |
| Dithizone | reagent | Sigma-Aldrich | D5130 |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
- Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
- Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
- Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
- Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
- Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
- Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
- Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
- Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
