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Biology

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

doi: 10.3791/1125 Published: May 26, 2009

Summary

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Abstract

Management von Typ 1 Diabetes ist belastend, sowohl für den Einzelnen und die Gesellschaft, im Wert von über 100 Milliarden Dollar jährlich. Trotz der weit verbreiteten Verwendung von Glukose-Monitoring und neue Insulin-Formulierungen, viele Menschen immer noch zu entwickeln verheerenden Folgekomplikationen. Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Transplantation kann bei normalen Blutzuckerspiegels bei Diabetes-Patienten wiederherstellen

Protocol

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1. Facility-Setup

  1. Menschliche Insel Isolation ist ein zeitkritischer Vorgang, dass Teamarbeit beinhaltet, und damit vier Personen werden benötigt, um dieses Verfahren durchzuführen. Das Team wird von den Chirurgen, wer und seziert cannulates der Bauchspeicheldrüse.
  2. Das Inselchen Isolation beginnt die Minute das Team in die UIC Insel absperrbar. Team-Mitglieder zu gewährleisten, dass alle notwendigen Instrumente, wie die Zentrifuge, wird geprüft und eingeschaltet ist. Sie machen auch sicher, dass alle Hauben und Flächen desinfizieren.
  3. Zwei Personen richtet die Kanülierung Tisch, Matsch-Maschine, die Verdauung Schaltung, Perfusion Einheit, COBE Reinigung Maschine und OP-Tische.
  4. Gleichzeitig werden zwei weitere Team-Mitglieder bereiten die Medien, die bei der Isolierung benötigt wird.
  5. Als nächstes werden die Bakteriologie Röhrchen (Flaschen, Rohre, Form und Tasche), die Probenahme-Röhrchen (mit Wasch-Fertigspritze) und Beurteilung Rohren und Platten hergestellt.
  6. Bereiten Sie die Reinigung Rohr wie folgt festgelegt: Der 1. Tube leer und markierte bei 150 ml, Röhrchen 2-12 Jahren mit 200 ml M199 Medium mit humanem Albumin (Waschlösung) ergänzt gefüllt und markierte bei 230 ml, und schließlich eine 50 ml konischen Rohr gefüllt mit 50 ml Waschlösung. Sobald diese vorbereitenden Schritte abgeschlossen sind wir bereit sind, beginnt die Vorbereitung und Perfusion des Pankreas.

2. Pancreas Vorbereitung und Perfusion

  1. Zu Beginn der Zubereitung und Perfusion des Pankreas entfernt ein Bediener die Orgel aus der Verpackung mit sterilem Technik. Der Chirurg wird in der Bauchspeicheldrüse die Dekontamination Tabelle zu übertragen.
  2. Der Chirurg wird eine 60 ml Spritze mit der ursprünglichen Bauchspeicheldrüse Konservierungslösung und geben es an einen Betreiber, die es benutzen werden, um vorbereitet "Procurement" Bakteriologie Flaschen füllen zu füllen.
  3. Nach einer Sichtkontrolle zu prüfen, ob die Orgel geeignet für kleine Insel-Isolierung (Wenn die Bauchspeicheldrüse bei der Beschaffung beschädigt oder anatomisch abnormal, sie dürfen nicht für Insel Isolierung verwendet werden), wird der Chirurg bitten, die Kollagenase vorzubereiten. Denken Sie daran, dass Resuspension Zeit zwischen verschiedenen Enzym Marken und viel variiert.
  4. Wenn der Chirurg fertig ist, bringen die Dekontaminationslösungen (Betadine, Fungizone / Cefazolin und HBSS), die Dekontamination Tisch und gießt sie in die entsprechenden Container. Chirurg führt Bauchspeicheldrüse Dekontamination Waschen für eine Minute der Bauchspeicheldrüse in jedem der Dekontaminationslösung. Die Bauchspeicheldrüse ist dann in einem kleinen sterilen Glas, in dem sie gewogen werden gestellt. Nach dem Gewicht in die Batch eingetragen ist, ist die Bauchspeicheldrüse in die Kanülierung Pfanne mit etwas Erhaltung Lösung gegeben.
  5. Der Chirurg wird ausgesetzt und teilweise incise den Hauptkanal und kanülieren jeweils die Hälfte der Bauchspeicheldrüse mit einer Kanüle. Die Kanüle wird durch Naht gesichert werden. Um perfuse der Bauchspeicheldrüse, bewegen sie die Durchblutung Einheit und gießen Sie die Enzymlösung in das Becken. Insgesamt Perfusion beträgt ca. 10 Minuten, bei 80 mmHg für 5 Minuten, dann bei 180 mmHg für 5 Minuten. Pancreas aufgetrieben nach Perfusion.
  6. Bewegen Sie den perfundierten Pankreas der Kanülierung pan, wo das Fettgewebe aus der Bauchspeicheldrüse getrimmt wird sorgfältig. Dann schneiden Sie die Pankreas in 10-12 Stück und Transfer zum Ricordi Kammer für die Verdauung.

3. Pankreas Verdauung

  1. Zu Beginn der Verdauung Schritt übertragen die Bauchspeicheldrüse an, die leeren Ricordi Kammer, fügen Sie eine 2,5 ml-Fläschchen von Pulmozyme, auf dem Bildschirm put (Vermeidung großes Stück Gewebe Block der Kammer), in der Nähe der Kammer, und füllen Sie das System.
  2. Starten Sie pumpt die Lösung für 5 Minuten. Schütteln Sie die Kammer gleichmäßig verteilen warme Lösung über. Nach fünf Minuten schütteln die Kammer für die gesamte Verdauung Phase. Pflegen Sie die Temperatur bei 37 ˚ C.
  3. Rock the Kammer leicht, bis die Temperatur erreicht 37 °, dann schütteln die Kammer. Nehmen Sie eine Probe alle zwei Minuten und erkennen, ob freie Inselchen in den Anwendungsbereich zu finden sind. Notieren Sie sich den Inselzellen Evaluation Informationen bei der Verdauung Tisch des Chargenprotokolls. Fahren Sie mit dem Prozentsatz der Inseln überwachen, bis es 50% von ihnen frei schwebend und isoliert in der Lösung sind.

4. Tissue-Sammlung

  1. Sobald 50% der Inseln zu finden sind kostenlos in den Proben, die Verdauung durch Zugabe von kaltem RPMI Verdünnungslösung in den Kreis gestoppt. Das Gewebe wird in 500 ml konische Röhrchen mit 30 ml Humanalbumin vorgefüllten gesammelt. Nachdem die Rohre sind gesponnen, Absaugen des Überstandes und Waschen des Pellets mit kalter Waschlösung. Drehen Sie das konische Röhrchen bei 1100 RPM (Umdrehungen pro Minute) für 1 Minute, 4 ˚ C.
  2. Kombinieren Sie alle Sammelröhrchen mit verdaut Pankreasgewebe in einer Einzeldosis von 500 ml konische ausgesetzt. Wenn ein Rohr voller gewaschen Gewebe, Spin und wiederholen Sie den Waschvorgang bis alle Gewebe hat mehrfach gewaschen worden. Spin dieses Rohr und den Transfer des Gewebes in einem 250 ml konischen Rohr. Bringen Sie das Volumen bis zu 250 ml mitM199 Waschlösung mit HA ergänzt und vorbereitet für die Probenahme.
  3. Nehmen Sie eine 1 ml Probe mit einer Pipette und hinzufügen, um eine 15 ml konische Röhrchen mit 9 ml Waschlösung vorgefüllt. Dann durch vorsichtiges Umdrehen des 15 ml konischen Rohr und aus dieser Mischung, Probe aus 1 ml direkt in ein Raster Zählschale. Zählen Sie die Zellen, und berechnen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Verdünnungsfaktor von 2500 (10x250).
  4. Drehen Sie das 250 ml konischen Rohr, und fügen Sie 150 ml UW (University of Wisconsin)-Lösung, die normalerweise für die Organkonservierung verwenden. Wenn UW hinzugefügt wird, mischen die Zellsuspension gründlich mit der Pipette. Record und kommunizieren, um die Reinigung Betreiber der Startzeit in UW. Verlassen Sie die Röhre (n) auf Eis und Strudel gelegentlich. Jetzt den Inseln kann weiter gereinigt werden.

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Discussion

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Es gibt eine Vielzahl von Faktoren, die die Isolierung Ergebnis 9,10. Unter ihnen spielt die Verdauung der Pankreasgewebe eine herausragende Rolle. Basierend auf unserer eigenen menschlichen Inselzellen isoliert Erfahrung, fassen wir folgende kritische Punkte, die potenziell beeinflussen könnten das Inselchen Ertrag und Qualität.

  1. Die Verdauung ist unterschiedlich, wenn verschiedene Arten von Enzymen genutzt werden.
  2. Sobald 40-50% der Inseln komplett aus acinärem Gewebe getrennt, sollte die Verdauung sofort durch Zugabe von Verdünnung Lösung und Abkühlung des Gewebes gestoppt werden.
  3. Schonende Behandlung des Gewebes beim Sammeln, Waschen und Mischen.
  4. Die Mischung aus gesammelten Gewebe und UW-Lösung sollte auf Eis mindestens 30 Minuten gesetzt werden, um eine bessere Reinigung Ergebnis zu erzielen.

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Acknowledgments

Unterstützt durch Mittel aus dem University of Illinois at Chicago sowie Inselzell Resource Center NIH (RFA-RR 05 bis 003), der Christopher-Stiftung, die Efroymson Foundation, und die Tellabs-Stiftung.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

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References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
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  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
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  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
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Cite this Article

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).More

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

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