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Biology

Isolamento Islet humana Pancreatic: Parte I: Digestão e Coleta de tecido pancreático

doi: 10.3791/1125 Published: May 26, 2009

Summary

Alcançar alta qualidade e quantidade adequada de ilhotas humanas é um dos pré-requisitos importantes para o transplante de ilhotas bem sucedido. Neste vídeo, descrevemos passo a passo os procedimentos para o isolamento de ilhotas pancreáticas humanas (parte I: a digestão e coleta de tecido pancreático), utilizando um método modificado automatizado.

Abstract

Gestão da diabetes tipo 1 é onerosa, tanto para o indivíduo ea sociedade, custando mais de 100 bilhões de dólares anualmente. Apesar do uso generalizado de monitoramento de glicose e insulina novas formulações, muitas pessoas ainda desenvolvem devastadoras complicações secundárias. Transplante de ilhotas pancreáticas pode restaurar controle quase normais de glicose em pacientes diabéticos

Protocol

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1. Facilidade de instalação

  1. Isolamento de ilhotas humana é um procedimento sensível ao tempo que envolve o trabalho em equipe e, portanto, quatro pessoas são necessários para realizar este procedimento. A equipe é liderada pelo cirurgião, que disseca e cannulates pâncreas.
  2. O isolamento das ilhotas começa o minuto a equipe entra na instalação de isolamento de ilhotas UIC. Membros da equipe assegurar que toda a instrumentação necessária, como a centrífuga, é verificada e ligado. Também certifique-se de higienizar todos os capuzes e superfícies.
  3. Duas pessoas irá definir a tabela de canulação, máquina de lama, circuito digestão, unidade de perfusão, máquina de purificação COBE, e mesas cirúrgicas.
  4. Simultaneamente, dois outros membros da equipe irá preparar os meios de comunicação que é necessária durante o isolamento.
  5. Em seguida, os tubos de bacteriologia (garrafas, tubos, forma e saco), tubos de amostragem (pré-carregada com lavagem), e tubos e placas de avaliação estão preparados.
  6. Prepare o tubo de purificação definido da seguinte forma: O primeiro tubo vazio e marcou a 150 ml, tubos de 2-12 preenchido com 200 ml de M199 meio suplementado com humanos (solução de lavagem) e albumina marcados em 230 ml e, finalmente, um tubo de 50 ml cônico preenchido com 50 ml de solução de lavagem. Uma vez que estas etapas de preparação estão completas estamos prontos para começar a preparar e irrigando o pâncreas.

2. Preparação pâncreas e perfusão

  1. Para começar a preparação e perfusão do pâncreas, um operador remove o órgão a partir de embalagens utilizando técnica estéril. O cirurgião fará a transferência do pâncreas para a mesa de descontaminação.
  2. O cirurgião vai encher uma seringa de 60 ml com a solução original pâncreas preservação e entregá-lo a um operador, que irá usá-lo para preencher preparado "Procurement" garrafas de bacteriologia.
  3. Depois de uma inspeção visual para determinar se o órgão é adequado para o isolamento das ilhotas (Se o pâncreas for danificado durante a colheita ou anatomicamente anormal, não pode ser utilizado para o isolamento das ilhotas), o cirurgião vai pedir um operador para preparar colagenase. Lembre-se que esse tempo re-suspensão varia entre as marcas e lotes diferentes de enzimas.
  4. Quando o cirurgião está pronto, traga as soluções de descontaminação (Betadine, Fungizone / Cefazolina e HBSS) para a tabela de descontaminação e despeje-os em recipientes apropriados. Cirurgião realiza a descontaminação de lavagem pâncreas por um minuto do pâncreas em cada um a solução de descontaminação. O pâncreas é então colocada em um pequeno frasco esterilizado no qual ele vai ser pesado. Depois que o peso é inserido no registro do lote, o pâncreas é colocado no pan canulação com algumas solução de preservação.
  5. O cirurgião irá expor e parcialmente inciso o duto principal e canular cada metade do pâncreas com uma cânula. A cânula será fixada por sutura. Para perfundir o pâncreas, primeiro movê-lo para a unidade de perfusão e despeje a solução enzimática para a bacia. Tempo de perfusão total é de cerca de 10 minutos, a 80 mmHg por 5 minutos, então a 180 mmHg por 5 minutos. Pâncreas distendido após a perfusão.
  6. Mover o pâncreas perfundido para o pan canulação, onde o tecido adiposo é cortado a partir do pâncreas com cuidado. Em seguida, corte do pâncreas em 10-12 pedaços e transferência para Ricordi Câmara para a digestão.

3. Digestão do pâncreas

  1. Para começar a etapa de digestão, o pâncreas a transferência da Câmara Ricordi vazia, adicione um frasco de 2,5 ml de Pulmozyme, colocar na tela (evitar grande parte do bloco de tecido da câmara), perto da câmara, e encher o sistema.
  2. Começar a bombear a solução por 5 minutos. Suavemente de rock da câmara para uniformemente dispersar solução quente por toda parte. Após cinco minutos, agite a câmara para a fase de digestão todo. Manter a temperatura a 37 ˚ C.
  3. Rock na câmara suavemente até a temperatura atinge 37 °, em seguida, agitar a câmara. Tomar uma amostra a cada dois minutos e detectar se ilhotas livres são encontrados sob o escopo. Registrar as informações de avaliação de ilhotas na tabela a digestão do registro do lote. Continuar a acompanhar o percentual de ilhotas até que haja 50% deles flutuando livres e isolados na solução.

4. Coleta de tecido

  1. Uma vez que 50% das ilhotas são encontrados livres nas amostras, a digestão é interrompida pela adição de solução de diluição RPMI frio no circuito. Tecido é recolhido em tubos de 500 ml cônico pré-cheias com 30 ml de Albumina Humana. Uma vez que os tubos são giradas, aspiração de fora o sobrenadante e lavar o pellet com solução de lavagem a frio. Girar os tubos cônicos a 1100 RPM (rotações por minuto) por 1 minuto, 4 ˚ C.
  2. Combine todos os tubos com exigibilidade suspensa tecido pancreático digerido em uma única de 500 ml. Quando um tubo está cheio de tecido lavado, spin e repita o processo de lavagem até que todo o tecido foi lavado várias vezes. Girar o tubo e transfira o tecido em um único tubo de 250 ml. Traga o volume até 250 ml comM199 solução de lavagem suplementado com HA e se preparar para a amostragem.
  3. Tomar uma amostra de 1 ml com uma pipeta e adicionar a um tubo cônico de 15 ml pré-cheia com 9 ml de solução de lavagem. Em seguida, misture suavemente invertendo o tubo cônico de 15 ml e deste, amostra para fora 1ml diretamente em um prato grade de contagem. Contar as células, e calcular o número de células usando um fator de diluição de 2500 (10x250).
  4. Girar o tubo de 250 ml e adicionar 150 ml de UW (University of Wisconsin) Solução que costumo usar para preservação de órgãos. Quando UW é adicionado, misture a suspensão de células, cuidadosamente, com a pipeta. Registrar e comunicar ao operador de purificação a hora de início na UW. Deixe o tubo (s) no gelo e agite ocasionalmente. Agora as ilhotas podem ser purificado ainda mais.

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Discussion

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Há uma variedade de fatores que afetam o resultado de isolamento 9,10. Entre eles, a digestão do tecido pancreático desempenha um papel proeminente. Baseado em nossa experiência humana de isolamento de ilhotas própria, resumimos seguintes pontos críticos, o que poderia influenciar o rendimento de ilhotas e qualidade.

  1. O tempo de digestão é diferente quando diferentes tipos de enzimas são utilizadas.
  2. Assim que 40-50% das ilhotas completamente separado do tecido acinar, a digestão deve ser imediatamente interrompida pela adição de solução de diluição e resfriamento do tecido.
  3. Manuseio suave do tecido ao coletar, lavar, e mistura.
  4. A mistura de tecidos coletados e solução de UW deve ser colocado em gelo por pelo menos 30 minutos a fim de obter melhor resultado de purificação.

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Acknowledgments

Apoiada por um financiamento da Universidade de Illinois em Chicago, assim como Cell Resource Islet Centro NIH subvenção (RFA-RR 05-003), a Fundação Christopher, a Fundação Efroymson, ea Fundação Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

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References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
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Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).More

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

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