Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы

doi: 10.3791/1125 Published: May 26, 2009

Summary

Достижение высокого качества и соответствующего количества человеческих островков является одним из видных предпосылки для успешной трансплантации островок. В этом видео мы опишем шаг за шагом процедуры человеческой изоляции островков поджелудочной железы (часть I: пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы), с помощью модифицированного метода автоматизированного.

Abstract

Управление диабетом 1 типа является обременительной, как для личности и общества, стоимостью более 100 миллиардов долларов в год. Несмотря на широкое использование мониторинга уровня глюкозы и новые формулировки инсулина, многие люди по-прежнему развиваться разрушительных вторичных осложнений. Трансплантация островков поджелудочной железы может восстановить около нормы контроля уровня глюкозы у больных сахарным диабетом

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Фонд установки

  1. Человек изоляции островок времени чувствительны процедура, которая включает в себя работу в команде, и, следовательно, четыре человека, которые необходимы для проведения этой процедуры. Команда под руководством хирурга, который анализирует и cannulates поджелудочной железы.
  2. Изоляции островок начинает минуту команда входит МСЖД объекта изоляции островок. Члены команды обеспечить принятие всех необходимых приборов, таких как центрифуги, проверено и включено. Кроме того, они обязательно дезинфицировать все капюшоны и поверхностей.
  3. Два человека будут созданы катетеризации стол, слякоти машину, пищеварение цепи, перфузии блок, COBE машины очистки и хирургических столов.
  4. Одновременно двое других членов команды подготовят средств массовой информации, которая необходима при выделении.
  5. Далее, бактериологии труб (бутылки, трубки, формы и сумки), отбор проб трубки (предварительно заполнены стирка), а также оценку трубок и пластин готовы.
  6. Подготовка очистки трубки устанавливается следующим образом: первая труба пуста и отмечена на 150 мл, 2-12 трубы заполнены 200 мл M199 среде с человеческий альбумин (промывочного раствора) и отмечены на 230 мл, и, наконец, один 50 мл коническую трубку заполнено 50 мл моющего раствора. После этих подготовительных шагов полная мы готовы приступить к подготовке и перфузии поджелудочной железы.

2. Подготовка поджелудочной железы и перфузии

  1. Для начала подготовки и кровоснабжение поджелудочной железы, оператор снимает органа от упаковки с использованием стерильной техники. Хирург передачи поджелудочной железы обеззараживания таблице.
  2. Хирург заполните одну 60 мл шприц с оригинальным решением сохранение поджелудочной железы и передать ее оператору, который будет использовать его, чтобы заполнить подготовленные «Закупки» бутылки бактериологии.
  3. После визуального осмотра, чтобы определить орган подходит для островок изоляции (Если поджелудочная железа повреждена во время закупок или анатомически ненормальным, оно не может быть использован для изоляции островок), хирург попросит оператора подготовить коллагеназы. Помните, что повторное приостановление время варьируется у разных брендов фермента и много.
  4. Когда хирург готов, принести обеззараживания решений (Бетадин, Fungizone / Цефазолин и HBSS) для обеззараживания стол и вылить их в соответствующие контейнеры. Хирург выполняет поджелудочная железа обеззараживание стиральную на минуту поджелудочной железы в каждой из обеззараживание раствором. Поджелудочная железа помещают в небольшие стерильные банки, в которых он будет взвешен. После вес вступил в партию записи, поджелудочная железа находится в катетеризации кастрюлю с некоторым сохранением решение.
  5. Хирург разоблачить и частично надрезать основной проток и иглу каждой половины поджелудочной железы с канюли. Канюля будут обеспечены шва. Чтобы заливать поджелудочной железы, первый шаг это единица перфузии и залить раствор фермента в бассейне. Общее время перфузии составляет около 10 минут, при 80 мм рт.ст. в течение 5 минут, затем при 180 мм рт.ст. в течение 5 минут. Поджелудочная железа раздутым после перфузии.
  6. Перемещение перфузии поджелудочной железы катетеризации кастрюлю, где жировая ткань удаляются из поджелудочной железы тщательно. Затем вырежьте поджелудочной железы в 10-12 штук и передачи Ricordi палаты для пищеварения.

3. Поджелудочная железа пищеварения

  1. Для начала пищеварения шаг, передача поджелудочной железы в пустую палату Ricordi, добавьте 2,5 мл флакон Pulmozyme, положить на экране (во избежание большой кусок ткани блок камеры), закрыть камеру, и заполнить систему.
  2. Начинайте выкачивать раствор в течение 5 минут. Осторожно камеры равномерно расходиться теплый раствор во всем. Через пять минут, осторожно встряхните камера для всей фазы пищеварения. Поддерживайте температуру 37 ˚ C.
  3. Рок камеры мягко, пока температура не достигнет 37 °, то трясти камеру. Возьмите образец каждые две минуты и обнаружить, если свободные островки находятся под область. Запись информации островок оценки в пищеварении таблицу партии записи. Продолжайте следить за процент островков, пока Есть 50% из них плавающей свободные и изолированные в растворе.

4. Ткани коллекции

  1. Как только 50% находятся островки свободной в образцах, пищеварение останавливали добавлением холодной RPMI разбавления раствора в контуре. Ткань собирается в 500 мл конические пробирки предварительно заполнены 30 мл альбумина человека. Как только трубы развернулся, всасывания от супернатант и мыть гранул с холодной промывочного раствора. Спиновые конических труб при 1100 RPM (оборотов в минуту) в течение 1 минуты, 4 ˚ C.
  2. Смешайте все коллекции трубы приостановлены с переваривается ткани поджелудочной железы в одной 500 мл конической. Когда трубка полна мыть ткань, спину и повторить процесс стирки, пока все ткани была мыть несколько раз. Спиновые эту трубку и передачи ткани в одном 250 мл коническую трубку. Довести объем до 250 млM199 моющего раствора дополнить ГК и подготовить для отбора проб.
  3. Возьмите 1 мл образца с пипеткой и добавить в 15 мл коническую трубку предварительно заполнены 9 мл моющего раствора. Затем смешать, аккуратно инвертирующего 15 мл коническую трубку и от этого, выборка из 1 мл прямо в сетку подсчета блюдо. Граф клеток, и рассчитать количество клеток использованием коэффициент разбавления 2500 (10x250).
  4. Спиновые 250 мл коническую трубку и добавить 150 мл UW (Университет Висконсина) Решение, которое обычно используют для сохранения органов. Когда UW добавляется, смешать клеточной суспензии тщательно с использованием пипетки. Запись и сообщить оператору очистки время начала в UW. Оставьте трубку (ы) на льду и водоворот случая к случаю. Теперь островки могут быть очищены дальше.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Есть множество факторов, влияющих на изоляцию результат 9,10. Среди них, переваривания ткани поджелудочной железы играет важную роль. Исходя из нашего собственного человеческого опыта изоляции островке, мы кратко изложены следующие критические точки, которые потенциально могут влиять на островке урожайность и качество.

  1. Пищеварения раз по-другому, когда различные виды ферментов используются.
  2. Как только 40-50% от островков полностью отделены от тканей ацинарных, пищеварения следует немедленно прекратить, добавив разбавления раствора и охлаждения ткани.
  3. Нежные обработки тканей при сборе, мойка, и смешивания.
  4. Смесь собраны ткани и UW решения должны быть размещены на льду в течение не менее 30 минут, чтобы получить лучший результат очистки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Поддержка финансирования из университета Иллинойса в Чикаго, а также островковых клеток ресурсный центр NIH грант (RFA-RR 05-003), Кристофер Фонда Efroymson Фонда, а Фонд Tellabs.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Ice Slush Machine equipment Taylor Company K4036546 make sterile ice
Centrifuge equipment Beckman Coulter Inc. 424803
MZ6 Inverted Microscopy TLBD4.1 equipment Leica Microsystems 4103
Cell Culture Dish with 2 mm Grid equipment Nalge Nunc international 174926 islet counting
Digital Water Bath EX7 equipment NesLab 105361058
Thermometer equipment IBI:IR 60444
MonoBloc Balance AB 104-S equipment Mettler Toledo 1119430864 measure pancreas weight
MasterFlex II Speed Controller equipment Cole-Parmer J00006445 adjust flow speed during degestion
Digital Sight DS L1 equipment Nikon Instruments 217267
Perfusion Unit equipment Custom Made n/a
Cooler for perfusion unit equipment Fisher Scientific 3013P
Ricordi Chamber equipment University of Miami n/a
RPMI dilution solution reagent Mediatech, Inc. 99783024
University of Wisconcin (UW) solution reagent DURAMED 1000-46-06
Hank’s Buffered Salt Solution (HBSS) reagent Mediatech, Inc. 99-597-CM
25% Human Albumin reagent GRIFOLS NDC 61953-0002-2
M199 media (wash solution) reagent Mediatech, Inc. 99-784-CM
Collagenase NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002937
Neutral Protease NB1 GMP grade reagent SERVA Electrophoresis N0002936
Betadine reagent Cardinal Health 29906-004
Cefazolin reagent West-Ward Pharmaceutical NDC 0143-9924-90
Dithizone reagent Sigma-Aldrich D5130

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
  2. Nano, R., et al. Islet isolation for allotransplantation: variables associated with successful islet yield and graft function. Diabetologia. 48, 906-912 (2005).
  3. Barbaro, B., et al. Improved human pancreatic islet purification with the refined UIC-UB density gradient. Transplantation. 84, 1200-1203 (2007).
  4. Lakey, J. R., Rajotte, R. V., Warnock, G. L., Kneteman, N. M. Human pancreas preservation prior to islet isolation. Cold ischemic tolerance. Transplantation. 59, 689-694 (1995).
  5. Fridell, J. A., et al. Comparison of histidine-tryptophan-ketoglutarate solution and University of Wisconsin solution for organ preservation in clinical pancreas transplantation. Transplantation. 77, 1304-1306 (2004).
  6. Potdar, S., et al. Initial experience using histidine-tryptophan-ketoglutarate solution in clinical pancreas transplantation. Clin Transplant. 18, 661-665 (2004).
  7. Salehi, P., et al. Human islet isolation outcomes from pancreata preserved with Histidine-Tryptophan Ketoglutarate versus University of Wisconsin solution. Transplantation. 82, 983-985 (2006).
  8. Ricordi, C., Lacy, P. E., Scharp, D. W. Automated islet isolation from human pancreas. Diabetes. 38, Suppl 1 140-142 (1989).
  9. Hanley, S. C., Paraskevas, S., Rosenberg, L. Donor and isolation variables predicting human islet isolation success. Transplantation. 85, 950-955 (2008).
  10. Toso, C., et al. Factors affecting human islet of Langerhans isolation yields. Transplant Proc. 34, 826-827 (2002).
Изоляция человека Островок поджелудочной железы: Часть I: Пищеварение и сбор ткани поджелудочной железы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).More

Qi, M., Barbaro, B., Wang, S., Wang, Y., Hansen, M., Oberholzer, J. Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125, doi:10.3791/1125 (2009).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter