Summary
Эта процедура использует синий свет активированных водорослей канала и клеточно-специфических генетических инструментов выражение, чтобы вызвать синаптических потенциалов с световые импульсы в нервно-мышечном соединении (NMJ) в
Abstract
Protocol
Часть 1: уход животных и генетического кресты
- Поддерживать UAS-ChR2 и OK371-GAL4 летать линий в отдельных флаконах, содержащих стандартные носители летать 8.
- Сбор дев OK371-GAL4 летать линий и самцов UAS-ChR2 линий.
- Положите обе мужчин и женщин в флакон, содержащий стандартные носители летать смешать с 1 мМ полностью транс-сетчатки (ATR). ATR пища должна быть сделана первая плавка на регулярных средах летать в микроволновой печи в течение ~ 1 минуты. Как только растаял, дайте ему остыть в течение приблизительно 30 секунд до одной минуты, а затем добавить 100 мкл 100 мМ АТР в 100% этанола на каждые 10 мл летать СМИ. Место флаконах по льду, затем хранить в темном месте при температуре 4 ° C.
- Давайте мухи спариваются и откладывают яйца в темном месте на 22-25 ° C.
- Подождите 3-4 дня до третьего возраста личинки видны, в тот момент, распоряжаться взрослых мух.
Часть 2: Буровая установка
- Приложите любые 10x рассекает часть рамки глаза (в нашем случае, от Carl Zeiss, Inc, www.zeiss.com, Торнвуд, Нью-Йорк), на синий светодиодный источник света с радиатором (Thor лаборатории, www.thorlabs.com, Ньютон, штат Нью-Джерси ). Присоединить к магнитным основанием с должности и зажимом. Крышка радиатора с заземлены щит для уменьшения электрических шумов, генерируемых источником света.
- Место магнитной базе с источником света в эфире таблице электрофизиологии буровой установки.
- Подключение источника света к цепи управления и подключения цепи управления для внешнего источника напряжения (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Колорадо-Спрингс, CO).
- Дайте 1-5 V импульсы на цепи управления, чтобы активировать синий свет.
- Отрегулируйте магнитным основанием и источником света, пока синий луч света направлен на площадь будет занимать личиночной рассечение.
Часть 3: Dissection
- Место шесть 0,1 мм насекомых булавки в пол sylgard подкладке блюдо.
- Удалить 3-го возраста личинки от пищи и место средств массовой информации в любой пластиковой Петри-блюдо.
- Промыть личинки физиологическим раствором для удаления остатков пищи.
- Место личинок в рассекает блюдо рядом вытащил булавки и добавить солевой до ½ уровне.
- Восток личинки, так что вы можете увидеть две серебристые трубки (трахеи) вдоль спинной поверхности животного.
- Вставьте большой контактный прямо в хвост между трахеи трубки. Держите личинки вниз и место второй большой палец в его голове, будучи уверенным, чтобы растянуть тело из продольно.
- Сделайте небольшой надрез около хвоста, и продолжать его длине тела. Убедитесь, что кончики ножницами подняты так, чтобы не случайно сократить вентральной нервах и / или мышцах стенки тела.
- Место четыре контакта на четырех углах животного теперь открыт животик. Установите их в рассекает блюдо так, чтобы филе животного. Pin подготовки из учили.
- Использование щипцы и ножницы, удалить внутренности животного, трахеи и жира тела.
- Промыть приготовительный с физиологическим раствором.
- Найдите лобных долей (как показано на рис) и брюшного ганглия преп.
- Использование микро-ножницы, аккуратно разрезать брюшную ганглия позади лобных долей.
Часть 4: запись в мышцах и синий световой стимуляции
- Вытяните 10-20 μω электрода с помощью электронной съемник электрода (Саттер Instruments).
- Заполните вытащил электрод с 3 М KCl.
- Место заполнены электрод в держатель электрода и наконечника маневра электрод с микроманипулятора ближайшее личиночные приготовительные под микроскопом на вскрытии электрофизиологии буровой установки.
- Определить мышц 6 (M6) в любом сегменте стенки тела (рис.).
- Осторожно вставьте электрод в M6 и наблюдать за быстрым гиперполяризации. Мышцы отдыхают потенциалов мембраны должна быть от -30 мВ до -70 мВ.
- Отрегулируйте синий свет так, что расчлененный приготовительные находится в центре светового луча.
- Дайте 20-100 мс импульсов напряжения цепи управления. Поэтапно увеличения напряжения, подаваемого на цепи управления. Следите за возбуждающим потенциалом перехода в мышечную клетку (рис. 1В).
Представитель Результаты:
Рисунок 1А показывает схема установки записи и филе подготовки. На рисунке 1б показаны типичные EJP вызванных короткими импульсами света. EJP амплитуды показали суммируются амплитуды от двух моторных нейронов известны как иннервируют M6. Нижняя интенсивности света активируется только один блок двигателя (данные не приведены).
Рисунок 1:) Общая схема внутриклеточных установки записи и с синим светодиодом. Мозг (Br) удаляется для подавления ритмической активности в брюшной ганглий (VG). ChR2 выражается в моторных нейронов использованием GAL4-UAS системы. Б) внутриклеточные записи с M6 мышцы. 40 мс синие световые импульсы (при 127 мВт / мм 2) надежно вызывают большой синаптических потенциалов (звездочки) в М6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги включают в себя как начальное вскрытие и внесение мышечные клетки. Если нервы вырезать или мышца повреждена во время начальной вскрытия трудно продолжать остальной эксперимента. Во время вскрытия, нужно быть очень осторожным, чтобы угол рассекает ножницы вверх как можно больше во время спинного разреза. Во второй важный шаг, вводя мышечных клеток, нужно следить за гиперполяризации прошлого ~ 30 мВ. Значения выше -30 мВ показывают, что электрод или не должным образом в мышечных клетках или в нездоровых клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У нас нет конфликта интересов раскрывать.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья гранты RO1GM-33205 и MH-067284 для LC Гриффит и летом Brandeis University студентов стипендию исследований Нью-Джерси Hornstein. Предварительные эксперименты для этой техники были выполнены в Морской биологической лаборатории в составе 2008 нейронные системы и поведение летний курс (NIMH гранта: R25 MH059472) в Вудс-Хол, Массачусетс.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
