Summary
Detta förfarande används en blå ljusaktiverat alger kanal och cell-specifika genetiska verktyg uttryck för att framkalla synaptiska potentialer med ljuspulser vid den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) i
Abstract
Den
Protocol
Del 1: Animal vård och genetiska korsningar
- Behåll UAS-ChR2 och OK371-GAL4 linjer flyga i separata flaskor innehållande standard flyga medier 8.
- Samla jungfrur av OK371-GAL4 flyga linjer och hanar av UAS-ChR2 linjer.
- Sätt både män och kvinnor i en injektionsflaska som innehåller standard flyga media blandas med 1 mm all-trans-retinal (ATR). ATR livsmedel bör göras genom att först smälta regelbundet flyga media i en mikrovågsugn för ~ 1 minut. När smält, låt svalna i cirka 30 sekunder till en minut och lägg sedan till 100 l 100 mm ATR i 100% EtOH för varje 10 ml flyga medier. Placera flaskorna på is, sedan lagra i ett mörkt område vid 4 ° C.
- Låt flugor para sig och lägga ägg i ett mörkt område på 22-25 ° C.
- Vänta 3-4 dagar tills 3:e INSTAR larver är synliga, vid detta tillfälle, avyttra av vuxna flugor.
Del 2: Rig inställning
- Bifoga 10x dissekera bit omfattning ögat (i vårt fall, från Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY), till blå LED ljuskälla med kylfläns (Thor Labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ ). Fäster magnetisk bas med post och klämma. Täck kylfläns med ett elektriskt jordad sköld för att minska elektriska störningar som genereras av ljuskällan.
- Placera magnetisk bas med ljuskälla på luft bord elektrofysiologi rigg.
- Anslut ljuskälla för att styra kretsen och koppla styrkrets till extern spänningskälla (Powerlab 4 / 30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).
- Ge 1-5 V pulser till styrkrets för att aktivera blått ljus.
- Justera magnetisk bas och ljuskällan tills blå ljusstråle fokuserar på ytan som skall upptas av larver dissekering.
Del 3: Dissection
- Placera sex 0,1 mm insekt stiften i golvet i ett sylgard-fodrad skålen.
- Ta bort en 3: e INSTAR larver från mat media och placera i någon plast Petri-skålen.
- Skölj larver med koksaltlösning för att ta bort mat.
- Placera larver i dissekera maträtt nära drog stiften och lägga koksaltlösning till ½ nivå.
- Orientera larver så att du kan se två silverfärgade rör (luftstrupe) löper längs djurets rygg yta.
- Sätt ett stort stift direkt i svansen i mellan Trakealtuber. Håll larverna nedåt och placera en andra stor nål i huvudet, var noga med att sträcka kroppen ut på längden.
- Gör ett litet snitt nära svansen, och fortsätter upp längden på kroppen. Se till att spetsen på saxen höjs så att de inte råkar skära ventrala nerver och / eller kroppen muskler vägg.
- Placera fyra stiften på de fyra hörnen av djurets nu öppen midsection. Ställ dem i dissekera skålen så att filé djuret. Pin förberedelse lärde ut.
- Använd pincett och sax, ta bort djurets inälvor, luftstrupe och fett organ.
- Skölj prep med koksaltlösning.
- Leta reda på frontalloberna (som kan ses i figur A) och ventrala ganglion av prep.
- Med en mikro-sax, försiktigt skära genom ventrala ganglion precis bakom frontalloberna.
Del 4: Muscle inspelning och blått ljus stimulering
- Dra en 10-20 μω elektrod med hjälp av en elektronisk elektrod avdragare (Sutter instrument).
- Fyll drog elektrod med 3 M KCl.
- Plats fylld elektrod i elektrodhållare och manövrera elektrod spets med en mikromanipulator nära larver prep i dissekera mikroskop på elektrofysiologi riggen.
- Identifiera Muscle 6 (M6) i varje organ väggsegment (Fig. A).
- Försiktigt in elektroden i M6 och titta för snabb hyperpolarisering. Muscle vila membran potential bör vara allt från -30 mV till -70 mV.
- Justera blått ljus så att dissekeras prep är centrerat i ljusstrålen.
- Ge 20-100 ms spänningspulser till styrkretsen. Stegvis öka spänning tillförs styrkretsen. Se upp för excitatoriska korsningen potentialer i muskelcellen (Figur 1B).
Representativa resultat:
Figur 1A visar en schematisk av inspelningen setup och filead förberedelser. Figur 1B visar typiska EJP framkallade av korta ljuspulser. EJP amplituden visas sammanfattas amplitud från två motoriska nervceller känd av båda innerverar M6. Lägre ljusintensiteter aktiveras endast en motorenhet (data visas inte).
Figur 1: A) Allmänna schematisk av en intracellulär inspelning rigg och med blå LED. Brain (Br) tas bort för att hämma rytmiska aktivitet i ventrala ganglion (VG). ChR2 uttrycks i motoriska nervceller med GAL4-UAS-system. B) Intracellulär inspelning från en M6 muskel. 40 ms blått ljus pulser (vid 127 μW / mm 2) framkalla tillförlitligt stora synaptiska potentialer (asterisker) i M6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg omfattar både den första dissektion och in i muskelcellerna. Om nerver skärs eller muskler skadas under den inledande dissektion är det svårt att fortsätta resten av experimentet. Under dissektion måste man vara mycket försiktig med att vinkla dissekera saxen uppåt så mycket som möjligt under dorsal snitt. Under det andra viktigt steg, in i en muskelcell måste man titta efter en hyperpolarisering senaste ~ 30 mV. Värden över -30 mV indikerar att elektroden är antingen inte riktigt inom en muskelcell eller en ohälsosam cell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inga intressekonflikter att lämna ut.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health bidrag RO1GM-33.205 och MH-067.284 till LC Griffith och genom en Brandeis University sommar grundutbildningen forskning stipendium till NJ Hornstein. Preliminära experiment för denna teknik utfördes vid marinbiologiska laboratorium som en del av 2008 Neural Systems och Behavior sommarkurs (NIMH bidrag: R25 MH059472) i Woods Hole, MA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard | Ellsworth Adhesives | 4019862 | www.ellsworth.com |
| Minutens Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | www.finescience.com |
| Dissecting Dish | Fisher Scientific | www.fishersci.com | |
| Neuroprobe Intracellular Amplifier and Head Stage | A-M Systems | 680100 | www.a-msystems.com |
| Powerlab 4/30 data acquisition system |  ADInstruments |
www.adinstruments.com | |
| Grass stimulator | Grass Technologies | www.grasstechnologies.com | |
| Desktop Computer | Dell | www.dell.com | |
| Dissecting Scope | Leica Microsystems | www.leica-microsystems.com | |
| Light Source | Dolan-Jenner Industries | 41446-062 | www.dolan-jenner.com |
| Fly Media | |||
| All-Trans-Retinal | Sigma-Aldrich | 116-31-4 | www.sigmaaldrich.com |
| OK-371 Gal4 Flies | Bloomington Stock center | ||
| UAS-ChR2 Flies | Fiala lab, Griffith lab | ||
| LED controller circuit | Built in Griffith lab | http://www.ledsupply.com http://www.futureelectronics.com Composed of: 1. 200 mA Buck Puck 2. Blue LED 3. Insulated wire 4. Circuit bread board |
|
| LED Heat Sink | Thorlabs Inc. | http://www.thorlabs.com/ | |
| Air Table | TMC | http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html | |
| Faraday Cage | Built in Griffith lab | ||
| Leica Leitz M Micro-Manipulator | Leica Microsystems | ACS01 | www.leica-microsystems.com |
| Electrode Holder | Axon Instruments | www.axon.com | |
| Borosilicate Glass | FHC, Inc. | www.fh-co.com/p14-15.pdf | |
| Electrode Puller | Sutter Instrument Co. | www.sutter.com | |
| HL 3.1 Saline with 0.8mM Ca2+ | Contents (mM): NaCl:70 KCl:5 CaCl2: 0.8 MgCl2:4Sucrose:115 NaHCO3: 10 Trehalose: 5 HEPES |
||
| Micro-Dissection Tools | Fine Science Tools | www.finescience.com |
References
- Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function. Annu Rev Neurosci. 19, 545 (1996).
- Collins, C. A., DiAntonio, A. Synaptic development: insights from Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35 (2007).
- Lagow, R. D., et al. Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion. PLoS Biol. 5 (4), e72 (2007).
- Nagel, G., et al. Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses. Curr Biol. 15 (24), 2279 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940 (2003).
- Schroll, C., et al. Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae. Curr Biol. 16 (17), 1741 (2006).
- Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers. Neuron. 14 (4), 707 (1995).
- Ralph Greenspan, Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).
