Summary
전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 여기서 우리는 플라스미드를 사용 표준 시약에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다.
Abstract
전체 plasmids의 사이트 이동 돌연변이 유발은 원래 플라스미드의 약간 다른 유사 콘텐츠를 작성하는 간단한 방법입니다. 이 방법으로 복제된 대상 유전자 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 변경할 수 있습니다. 그것은 단순히이 아닌 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응 동안 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 이 비디오 튜토리얼에서 우리는 플라스미드에 기본 재료를 소개하는 쉽고 비용 효과적인 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 표준 시약 작동 종종 매우 비싼 상용 키트에서 독립적입니다. 이 프로토콜을 적용하는 것은 그것이 상업 키트의 일부를 사용하는 비용은 무엇 여덟째에 대한 반응의 총 비용을 줄일 수 있습니다. 이 비디오에서 우리는 또한 과정에서 중요한 단계에 대해 언급하고 mutagenic primers를 디자인하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다.
Protocol
방법의 원리 :
이 사이트는 전체 plasmids의 돌연변이 유발이 동영상에 직접 플라스미드로 몇 기지의 대체, 삭제 또는 삽입하여 복제된 대상 유전자를 변경할 수있는 돌연변이 유발 방법이 설명 감독. 그것은 비 PCR 기반 thermocycling 반응에서 전체 플라스미드를 확장하여 사용할 수 있습니다. 반응하는 동안 원래의 플라스미드에 불일치의 형태로 원하는 돌연변이를 운반 mutagenic primers는, 새로 합성 플라스미드에 통합되어 있습니다. 반응에서 원래 플라스미드의 제거 후 변이 플라스미드가 E.으로 변화 도착 이 방법의 돌연변이 효율이 100 % 없기 때문에 대장균. 다음 단계만을 심사 목적으로하고 있습니다. 전체 절차는 사흘 걸리지만 주요 부분은 하루 이내에 할 수 있습니다.
1.0 하루에 한 :
1.1 Thermocycling 반응 :
원본 플라스미드 : 돌연변이 유발 프로토콜을 감독이 사이트 10킬로바이트까지 plasmids와 함께 잘 작동됩니다. 큰 Plasmids이 방법으로 공격하는 조금 어려운 일부 인내와 thermocycling 조건 및 / 또는 관할 세포의 조절이 걸릴 수 있습니다. 또한 당신이 작업하는 플라스미드는 댐 + 박테리아 스트레인으로부터 격리해야합니다. thermocycling 반응을 위해 당신이가 자신을 공격하려는 플라스미드의 10-60 ngs 필요합니다.
Primers : 당신 thermocycling 반응을 설정할 수 전에 손에에서 primers을 가지고있다. 당신은 모든 mutagenic 입문서 약 150 NG가 필요합니다. 당신이 1시 10분 희석 100 PM 주식의 1.5 μl을한다면 그것은 괜찮습니다. 귀하의 mutagenic primers를 디자인할 때 고려해야 할 몇 가지 간단한 지침이있다 :
- primers 서로 보완되어야
- primers 길이 25 45 세포핵 사이 여야합니다
- 원래 플라스미드에 불일치 형태의 변이는 두 primers에 포함되어 있어야합니다
- 불일치는 뇌관 중심으로 각 면에 최소한 8 세포핵 둘러싸인해야
- primers 적어도 40 % GC - 내용이 있어야합니다
- primers는 하나 이상의 거시기 뭐냐 또는 고사 5 총리 3 프라임을 종료해야합니다
- primers는 phosphorylated 필요가 없습니다 없으며 그들은 단지 그들이해야 desalted FPLC 또는 페이지 정화,해야 할.
- TM의 계산에 대해 어떤 수식하지만 배송 인증서 TM이 60 이상되어야 ° C. 필요하지 않습니다
- 심사 목적을 위해 그것은 당신의 돌연변이와 제한 사이트를 삽입하거나 삭제하는 실용적입니다. 때문에 유전자의 변성의 원하는 돌연변이와 제한 사이트를 삽입할 수있는 많은 가능성이 있습니다. 뉴잉글랜드 Biolabs의 웹사이트는 적절한 제한 사이트를 찾을 수있는 도구를 제공합니다. 간단히 DNA에 대한 모호함 코드를 사용하여, 당신이 원하는 아미노산 서열에 대한 코딩하여 프라이머 시퀀스를 입력합니다. 효소 찾기 도구는 제한 사이트가 원하는 돌연변이에 평행 도입 수있는 당신에게 말할 것이다. 이 방법으로 모든 가능한 한 실제적인 제한 사이트를 찾을 수 없다면, 당신은 돌연변이의 사이트에있는 유전자에 관한 새로운 제한없이 사이트를 삽입할 수 있습니다. 이후이 제한 사이트가 새로운 mutagenic primers 삽입에 의해 삭제됩니다되는 돌연변이 시리즈를위한 템플릿으로이 플라스미드 사용할 수 있습니다. 당신이 플라스미드 같은 사이트에서 돌연변이의 시리즈를 할 계획이라면이 방법은 매우 편리합니다.
DNA - 효소 :이 방법 여러분은 3' - 5 'Exonuclease 활동을 전시하고 뭉툭한 끝을 만들어 내열성 DNA 중합 효소 - 필요합니다. 우리는 항상 Fermentas에서 재조합 Pfu - 중합 효소를 사용합니다. 당신이 증폭 단계에 문제가있다면 당신은 높은 품질의 효소를 시도 수도 있지만 대부분의 목적에 표준 Pfu 충분합니다. dNTPs, 효소 버퍼와 물로 반응을 완료합니다.
1.2 Thermocycling 조건
thermocycler은 다음과 같은 방법으로 설정되어야합니다. 초기 및 반복 변성 단계는 95 ° C.에 30sec로 설정됩니다
primers의 어닐링 온도는 복잡한 수식 계산해서는 안됩니다. 우리는 일반적으로 55 ° C 및 1 분 어닐링 시간 어닐링 온도를 설정합니다. 당신이 대부분 사용합니다 25-30 세포핵의 primers 경우, 이것은 우리의 시간의 95 %를 작동합니다. 60 ° C. -이 일을하지 말아야하는 경우 여하튼, 간단하게 50 사이의 어닐링 온도를 변화 시도
신장 온도는 사용하는 효소에 따라 달라집니다. 이 예제에서 우리는 72 신장 온도 요구 Fermentas에서 Pfu - 효소 ° C.를 사용하여 연신율 시간은 플라스미드의 크기에 따라 다릅니다. 우리는 항상 킬로바이트 당 1 분을 계산하고, 그 한 분 추가 추가시간. 예를 들어, 9킬로바이트 플라스미드에 대해 우리는 연신율 시간 10 분 선택한 것입니다.
18 사이클 정도 추가로 사용하기 위해 플라스미드 변이 만드는 데 충분합니다. 낮은 사이클의 수를 유지, 또한 시간을 절약할 수 있습니다.
Thermocycling 반응 후 1.3 Gelcheck
성공적인 확대는 전기 영동을 수행하여 확인한다. 자전거가 완료 직접 후, 1 %의 태 아가로 오스 겔에 반응 5 μl를로드합니다. 증폭이 성공했다면, 당신은 별개의 밴드를 확인할 수 있습니다. 새로 합성된 DNA가 젤에 명확하게 표시되지 않으면 그러나 전체 반응을 촉진하려고하고 다음 단계에서 변환을 위해 사용할 수 있습니다. 우리를 위해 이것은 거의 효과가 없어 가지고 있지만 사용해 가치가있다. 반응이 작동하지 않을 경우에 가장 좋은 것은 어닐링 온도를 조절하는 것입니다.
1.4 DpnI의 소화 :
변환하기 전에 템플릿으로 제공하는 원래의 플라스미드가 강한 배경을 방지하기 위해 반응에서 제거되어야합니다. 이 DpnI로 제한 소화에 의해 이루어집니다. 이 제한 endonuclease는 플라스미드 methylated 상처. A는 methylated되어야 반면, 그 인식 및 제한 사이트는 시퀀스 GATC입니다. DpnI와 소화 경우에만 댐에서 고립되었던 원래 unmutated 플라스미드가 + 변형이 탈락, methylated되지 않은 새로 합성 변이 플라스미드는 DpnI에 의해 영향을받지 않습니다. 단순히 반응 DpnI 1-2 μl를 추가하고 37에서 적어도 한 시간을 품어 °. 빠른 다이제스트 DpnI을 사용할 때 배양 시간은 15 분 감소 수 있습니다. 귀하의 DpnI이 제한 소화의 배양 시간의 품질이 크게 unmutated 플라스미드와 배경이되는 방법을 강한 결정합니다.
1.5 변환 :
DpnI는 소화 후 플라스미드는 유능한 E.으로 변환을위한 준비 대장균 세포. 간단히 관할 세포에 DpnI의 소화 반응에서 5 μl을 추가하고 실험실에서 권장하는대로 변환을 수행합니다. 우리 사건에서 우리는 30 분 얼음 박테리아 - 플라스미드 혼합 잠복기 후 42 ° C 90 초에서 열 충격 그걸로 열 충격 절차를 사용합니다. 200 μl SOC - 솔루션을 추가하면, 박테리아는 적극적으로 한 H. 위해 37, ° C를 흔들어, incubated 아르 일시간 후 세균은 한천 미디어를 선택을 도금하고 있습니다.
2.0 하루에 두세
클론 1 부 2.1 심사 : 클론의 선택
돌연변이 효율이 100 %가 아니므로 귀하의 돌연변이에 대한 화면으로 필요합니다. 우리는 우리가 추가하거나 뇌관 통합을 통해 삭제된 제한 사이트의 존재 또는 부재를 확인하는 제한 소화하여이 작업을 수행할. 이러한 목적을 위해 우리는 보통 여덟 식민지를 선택하고 다음날 플라스미드 준비 밤새도록 그들을 성장.
3.0 지나고 3
클론 2 부 3.1 상영 : 마커 효소로 제한 소화
셋째 날에는 당신의 마커 효소와 미니 준비와 후속 제한 소화를 수행합니다. 겔에서는 다음 원하는 돌연변이를 운반하고있는 사람 아닌 클론 어느 확인할 수 있습니다.
제한 소화를 사용하는 심사 방법은 잘 작동합니다. 그럼에도 불구하고, 당신은 시퀀싱하여 성공적인 돌연변을 확인합니다.
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Discussion
사이트 감독 돌연변이 유발이 플라스미드에 의해 운반 유전자를 공격하는 빠른 방법을 제공하는 돌연변이 유발 - 방법입니다. 전체 반응은 하루에 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면, 그것은 단지 원하는 변이를 가지고 무료 primers 한 쌍의 등 Pfu - 효소로 교정 효소가 필요합니다. 새로 합성된 플라스미드는 제한 효소 DpnI와 반응을 소화하여 부모의 플라스미드 분리 수 있습니다. 이 효소는 methylated DNA를 요약. 따라서 오직 새로 합성 플라스미드는 변형하실 수 있습니다. 이 튜토리얼에서 우리는 수제 돌연변이 유발 키트를 사용하여 사이트 이동 돌연변이 유발을 수행 보여주었다. 이 키트의 장점은 효과가 남아있는 동안 절약 비용입니다. 이 방법의 중요한 포인트는 뇌관 디자인과 어닐링 온도입니다. 경우에는 새로 합성 DNA가 전기 후, 방법의 실패를 표시 할 수있는, 하나는 박테리아의 변환에 대한 전체적인 반응과 사용을 촉진하기 위해 시도할 수 시각 수 없습니다. 그러나이 문제를 해결하는 가장 좋은 방법은 어닐링 온도를 최적화하거나 primers의 불변 영역의 길이를 증가하고있다. 또한, 고품질의 효소 또는 제한 효소를 사용하면 반응의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 유능한 세포는 또한이 방법의 successfulness 효과가 핵심 요소입니다. 따라서 중간 (107 cfu / μg의 DNA) 또는 매우 (109 cfu / μg의 DNA) 유능한 세포가 바람직합니다.
이 튜토리얼에서 우리가 만든 키트를 사용하여 삭제하거나 삽입을 보여주는 못했지만, 우리 연구실에서 이러한 일을 성공적으로되었습니다. 우리는 성공적으로 동시에 적어도 3 기지를 대체 삽입하거나 삭제할 수있었습니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pfu polymerase (recombinant or native) | Fermentas | EP0571 or EP0501 | |
| dNTP mix 10 mM | Fermentas | R0191 | |
| DpnI or DpnI Fast digest | Fermentas | ER1701 | |
| primers | Invitrogen | desalted |
References
- Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. QuikChange site-directed mutagenesis. Strategies. 9, 3-4 (1996).
