自制的网站定向诱变整个质粒

Summary

网站定向诱变整个质粒是一种简单的方法来创建原始质粒略有不同的变化。在这里，我们展示了一个简单而成本效益的方法，引入碱基质粒使用的标准试剂。

Abstract

网站定向诱变整个质粒是一种简单的方法来创建原始质粒略有不同的变化。使用这种方法克隆的目标的基因可以被改变替换，删除或插入直接插入质粒几个基地。它的工作原理简单地放大整个质粒在非基于PCR的热循环反应，。在反应过程中所需的突变，诱变引物，携带集成到新合成的质粒。在这个视频教程中，我们展示了一个简单而成本效益的方法，引入质粒碱基。该协议的工作原理与标准试剂，是独立于商业试剂盒，这往往是非常昂贵的。应用此协议可以降低总成本反应到什么成本，使用一些商业试剂盒第八。在这段视频中，我们还评论的关键步骤，在此过程中，给如何设计的诱变引物的详细说明。

Protocol

方法原理：

现场指挥整个质粒的突变解释这个视频是一个突变的方法，可以让您改变由直接到质粒的克隆目标基因替换，删除或插入几个基地。它的工作原理，放大整个质粒，在非基于PCR的热循环反应。在反应过程中，致突变的引物，携带所需的突变原质粒，在不匹配的形式集成到新合成的质粒。拆除原质粒从反应后的突变质粒得到转化E.大肠杆菌下面的步骤是筛选目的，因为这种方法的突变效率不是100％ 。整个过程需要3天，但可以在一天之内完成的主要部分。

1.0第一天：

1.1热循环反应：

原始质粒：质粒到10KB，定向诱变协议本网站作品最好的。较大的质粒是一个发生变异，这种方法有点困难，可能需要一些耐心和调整的热循环条件和/或主管细胞。此外，质粒你一起工作的，必须被隔离，从大坝+菌种。对于热循环反应，你将需要10至60农工商你想变异的质粒。

底漆：之前，您可以设置您的热循环反应，你必须有你的引物在手。您需要约150纳克每诱变引物。这是确定的，如果你取1.5μL1:10稀释100时股票。有一些简单的指导，您的诱变引物设计时，必须考虑：

• 引物应相辅相成
• 25和45个核苷酸引物之间应
• 原质粒的不匹配的突变形式，都必须包含在这两个引物
• 引物的不匹配，应集中在两侧每侧至少8个核苷酸
• 引物应该有至少40％的GC -内容
• 引物应与一个或多个GS或CS结束5首相和总理3
• 引物需要不被磷酸化，也没有FPLC或PAGE纯化，只是脱盐他们应该。
• 对于TM的计算，你不需要任何的公式，但航运证书的TM应高于60 ° C。
• 筛查的目的是实际插入或删除您的突变限制网站。由于变性的遗传密码，有很多可能性，插入你想要的突变的限制站点。 New England Biolabs公司的网站提供了一个工具来寻找这样一个合适的酶切位点。只需输入您的引物序列编码的氨基酸序列，你的愿望，利用DNA的模糊代码。酶查找工具会告诉你可以引入酶切位点的平行您想要的突变。如果你不能找到任何可能的或实际的酶切位点，通过这种方式，你可以插入任何新的限制网站没有有关的突变位点的遗传密码。此后，您可以使用此一系列在此限制的网站将通过插入新的诱变引物的删除突变模板质粒。如果你打算在同一站点的质粒做了一系列的突变，这种方法可能会很方便。

DNA聚合酶：对于这个方法，你需要一个耐高温的DNA聚合酶具有3' - 5'外切酶活性和创造两端钝。我们总是用自Fermentas重组PFU聚合酶。如果你有扩增步骤的问题，你可以尝试更高质量的聚合酶，但对于大多数用途的标准PFU就足够了。完成dNTPs，聚合酶缓冲液和水的反应。

1.2热循环条件

的热循环应以下列方式设立。最初的和经常性的变性阶段设置为30秒在95 ° C。

引物的退火温度不得与复杂的公式计算。我们通常设置的退火温度为55℃，退火时间为一分钟。您将主要使用25到30个核苷酸引物，这对我们95％的时间。总之，如果这是不应该的工作，简单地尝试不同的退火温度 - 50至60 ° C

伸长温度取决于您使用的聚合酶。在这个演示中，我们使用自Fermentas PFU聚合酶，伸长温度为72 ° C。伸长时间根据质粒的大小而有所不同。我们总是计算每KB 1分钟，并额外添加了一分钟，时间。例如，对于一个9KB质粒中，我们会选择伸长时间10分钟。

18个周期是不足以创造足够的突变，为进一步使用质粒。饲养周期低的数目，也节省您的时间。

1.3 Gelcheck后热循环反应

应检查执行电泳成功扩增。骑自行车已完成后直接加载到1％TAE琼脂糖凝胶5μL的反应。如果放大成功，你应该看到一个独特的乐队。 ，但是，如果新合成的DNA不是在凝胶上清晰可见，你可以尝试沉淀整个反应，并使用它在下一步改造。对于我们来说，这很少的工作，但值得尝试。如果反应不工作的最好的办法是调整退火温度。

1.4 DpnI消化：

改造前的原始质粒作为模板，必须从反应，以防止强烈的背景。这是通过限制DpnI消化。这只有甲基化的质粒限制性内切酶切割。其识别和酶切位点序列GATC，而A已被甲基化。 DpnI消化时只有原来的unmutated质粒是从大坝隔离+菌株得到削减，新合成的突变质粒，这是没有甲基化不影响DpnI。只需添加1-2 DpnIμL的反应，并培育至少一个小时，在37 °。当使用快速的消化DpnI，孵育时间可以减少到约15分钟。 DpnI这酶切的孵化时间的质量在很大程度上决定unmutated质粒的背景将是多么强大。

1.5转型：

DpnI消化后的质粒是准备转型到主管大肠杆菌大肠杆菌细胞。只需添加5μLDpnI消化反应，主管细胞，并建议在你的实验室进行改造。在我们的例子中，我们使用热休克过程，孵化30分钟冰的细菌质粒的混合物，然后在42 ° 90彗星秒热休克。加入200μLSOC解决方案后，细菌培养，大力摇晃，在37 ° C为1小时1小时后的细菌接种于琼脂培养基选择。

2.0第二天

2.1克隆筛选第1部分：克隆选择

由于突变的效率不是100％，您需要为您的突变体屏幕。我们通过酶切，在我们为我们添加或删除，通过引物一体化的酶切位点的存在或缺乏检查。为此，我们通常拿起8个殖民地，增长质粒准备第二天晚上。

3.0第三天

3.1筛选克隆的第2部分：限制标记酶消化

第三天，执行一个迷你准备与您的标志酶和随后的酶切。在凝胶上，然后您可以看到一个克隆进行所需的突变，哪些不是。

使用酶切筛选方法工作得很好。然而，您应该确认您的成功突变经测序。

Discussion

网站定向诱变的方法，该方法提供了一种快速变异基因质粒进行了一个突变。只有一天可以完成整个反应。使用这种方法，将只需要一对携带所需的突变免费引物和一个校对，如PFU聚合酶聚合酶。新合成的质粒可以脱离父母的质粒，通过消化反应与限制性内切酶DpnI。这种酶消化甲基化的DNA。因此，只有新合成的质粒可转化。在本教程中，我们展示了表演一个网站定向诱变，通过使用自制的诱变套件。本试剂盒的好处是节省成本的有效性仍然存在。这种方法的关键点的引物设计和退火温度。情况下，新合成的DNA不能可视化电泳后，这可能表明该方法的失败，可以尝试沉淀整个反应和改造细菌使用它。但解决这个问题的最好办法是尝试，优化退火温度或增加恒定区引物的长度。此外，使用高品质的聚合酶或限制性内切酶，还可以提高反应的灵敏度。主管细胞也影响了该方法的顺手的一个关键因素。因此，主管细胞中（107 CFU /微克DNA）或高度（109 CFU /微克DNA）是可取的。

虽然在本教程中，我们并没有表现出使用国产试剂盒的缺失或插入，我们成功地在我们的实验室做这些。我们可以在同一时间成功地替代，插入或删除至少有3个碱基。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pfu polymerase (recombinant or native)	Fermentas	EP0571 or EP0501
dNTP mix 10 mM	Fermentas	R0191
DpnI or DpnI Fast digest	Fermentas	ER1701
primers	Invitrogen		desalted